Отдел продаж

Телефоны: (3532) 25-27-22, 93-60-02, 93-50-02

E-mail: [email protected]

г.Оренбург, ул.Беляевская, д.50/1, стр.1

 

Разное

Ворота из профиля: Как установить ворота из профнастила

Содержание

Ворота из профнастила своими руками

У любого ограждения по периметру участка индивидуальной застройки должны быть ворота для въезда автомобиля на территорию и комфортный вход для людей. При этом, для обеспечения защиты от проникновения посторонних, конструкция калиток и ворот должна быть довольно прочной. Профнастил – один из тех материалов, который соответствует данному требованию.



Какой тип ворот выбрать

Из профнастила можно построить разные виды ворот, но основными являются:

  1. Откатные ворота, позволяющие заметно сэкономить пространство в процессе их открывания. Ворота движутся вдоль забора и полностью откатываются вбок. Есть три типа таких ворот: подвесные (традиционные или гаражные), консольные и на колёсах. Консольные – самые популярные, так как они не препятствуют въезду транспорта.

  2. Распашные ворота, встречающиеся чаще остальных. Несмотря на то, что для использования таких ворот требуется много свободного места, они привлекают людей низкой стоимостью и простотой изготовления.

  3. Распашные ворота с калиткой. Иногда не очень удобно при выходе открывать обе створки ворот, по этой причине в них делают небольшую калитку.

  4. Декоративные ворота, украшенные разнообразными коваными элементами. Для изготовления красивых ворот с применением художественных декоративных металлических элементов необязательно быть кузнецом. Такие ворота можно купить в специализированных магазинах, а для их сборки понадобятся только навыки сварщика.



Необходимые инструменты

Как сделать оригинальные въездные ворота из профнастила на даче своими руками? Существуют разные схемы и чертежи с размерами под любой приусадебный участок, нужно только приобрести необходимые материалы и выполнить простую работу.

Для изготовления потребуются такие инструменты, как:

  • карандаш, рулетка, уровень;

  • сварочный аппарат;

  • крестовая отвертка или шуруповерт;

  • болгарка;

  • кисть для покраски и грунтовки;

  • дрель.

Также необходимо заранее подготовить требуемое количество профлиста, металлопрофиля, болтов и саморезов.

Если по периметру участка уже есть ограждение из данного материала, то профнастил для ворот подбирают такого же цвета. Следует также подготовить подходящие петли, способные выдержать общий вес будущей конструкции. Если ворота предполагают встроенную калитку, то засов с петлями нужно подобрать и под нее.



Как построить ворота из профнастила своими руками

  1. Сначала из металлопрофиля при помощи болгарки отрезают куски нужного размера, потом на ровной поверхности собирают раму для створок.

  2. На первом этапе уголки немного прихватываются сваркой, а потом еще раз проверяются по длине, высоте и диагонали.

  3. Внутри рамы для жесткости привариваются перемычки, затем, если нужно, замки, петли и запоры.

  4. После того, как каркас полностью готов, его подвергают антикоррозийной обработке, грунтовке и покраске.

  5. Когда основная часть ворот собрана, прикрепляются остальные конструкции: крыша, декоративные детали, арочные проемы.

Несмотря на то, что профнастил не сильно тяжелый материал, для высоты створок в 2 м нужно сделать заглубление опор как минимум на 0,7 м в грунт. Для каждой опоры следует вырыть яму размерами 20 на 20 см, а после помещения в нее труб она заливается бетоном. Раствор необходимо усилить при помощи арматуры.

В случае воротных опор из бетона, кирпича или природного камня также используется надежное основание глубиной не меньше 1,5 м. особенная внимательность необходима при соблюдении вертикального положения всех столбов. Следует отметить, что при установке ворот необходимо тщательно проверять все размеры и положение ворот, так как от этого зависит легкость их открывания.



Как поставить ворота

  1. Как правило, обшивка профнастилом осуществляется с внешней стороны дачного участка. Кто-то в декоративных целях делает это и со стороны дома.

  2. Листы могут быть высотой 2-2,5 м. длина может быть разной, есть возможность выбрать лист, захватывающий всю ширину створки ворот.

  3. Профлисты крепят к каркасу, используя клепки или саморезы по металлу.

  4. Несущая рама ворот отделывается профилированными листами довольно просто. Сначала листы прикрепляются по контуру, затем прикручиваются к внутренним перемычкам. Соединение двух листов происходит на верхней части волны (гребне).

  5. Если в качестве опор ворот выбраны столбы из тяжелых деревянных брусьев, то установку петель или железной рамы следует осуществлять при помощи болтов или анкеров для дерева длиной 12,5 – 22 см.

  6. Петли приваривают сначала на опорные стойки ворот из профнастила, затем на их каркас, отступая при этом 20-30 см от края. Хватит двух штук на каждую створку, однако с целью перестраховки нередко используют по 3 штуки.

  7. Потом петли необходимо смазать, а створки навесить на опоры.

При четком соблюдении всех норм в результате должны получиться готовые к использованию ворота.

Для монтажа ворот и калитки из профнастила понадобятся относительно небольшие деньги, а вся работа по установке займет не так много времени. Монтаж распашных ворот из профилированного листа следует осуществлять с соблюдением норм безопасности и привлечением одного или двух помощников.

Ворота Из профнастила в Пятигорске цена

Изготавливаем распашные и откатные ворота из профнастила в Пятигорске и КМВ. Выберите ворота из каталога с актуальными ценами или закажите конструкцию из профилированного листа по индивидуальным размерам. Предоставляем гарантию по договору, а так же бесплатную доставку по Пятигорску и КМВ.

Купить ворота из профнастила в Пятигорске

Профнастил — один из самых популярных материалов-наполнителей для ворот за счет относительно невысокой стоимости и отличных эксплуатационных характеристик. Изготавливается профнастил из оцинкованного листового металла, который формуется прокатным прессом. Так благодаря формовке он имеет высокую степень жесткости за счет чего створка не «гуляет», но при этом весит очень мало, что позволяет комфортно открывать и закрывать ворота вручную.

Один из главных плюсов этого материала — износостойкость и долговечность. Мы производим ворота из профнастила C8, который изготавливается из оцинкованной стали и покрывается специальными составами — полиэстер или пурал. Данные полимерные покрытия увеличивают срок службы оцинкованного металла в 2-3 раза, до 30-50 лет. Внешний вид материала практически не меняется со временем и он будет выглядеть как новым как минимум 10-15 лет.

Большим преимуществом профлиста c8 является большой выбор цветов и оттенков — доступно более 30 цветовых решений, а также имитация под фактуру дерева и кладку кирпича, что позволит гармонично вписать ворота в композицию въездной группы.

Ворота из профнастила относятся к сегменту бюджетной продукции, выглядят аккуратно, но довольно просто. Чтобы сделать их внешний вид более премиальным мы предлагаем украсить створки и калитку элементами ковки. За небольшую доплату вы получите ворота, которые выгодно отличаются от стандартных конструкций. Удачное сочетание красного и профиля темных тонов с ковкой черного цвета часто можно встретить на въезде частных домов.

Вся продукция доступна для доставки и монтажа в Пятигорске, Ессентуках, Кисловодске, Георгиевске, Минеральных Водах и других городах КМВ.

Заказать ворота из профнастила

В каталоге представленны ворота из профиля с типовой комплектацией, если вы не смогли подобрать среди имеющихся моделей необходимую конструкцию мы можем изготовить профильные ворота на заказ по индивидуальным размерам. В этом случае вы самостоятельно формируете конечную стоимость изделия за счет выбора класса комплектующих и автоматического привода. Все необходимые замеры, выезд нашего специалиста и первичная консультация абсолютно бесплатны. Так же вас может заинтересовать продукция из следующих разделов:

Установка распашных ворот из профнастила

Ворота для забора из профнастила

Конструкция ворот может предполагать наличие одной или двух створок. Створки обычно дополнительно усиливаются горизонтальными или диагональными балками, что придает дополнительную жесткость их конструкции. Для широких ворот наша компания предлагает установку съемных поперечных балок на высоте. Такие балки легко снимаются при необходимости и при этом обеспечивают повышенную надежность всей конструкции.

Почему заказать ворота из профнастила стоит в нашей компании?

На это есть сразу несколько причин.

  1. Высокое качество ворот. Мы устанавливаем нашим клиентам металлические ворота, конструкция которых усилена дополнительными балками. При этом используется только качественная фурнитура — выбору петель и запоров уделяется максимум внимания. Ворота обычно окрашиваются в тон забора так, что все ограждение выглядит эстетично. При установке ворот возможно выполнение дополнительных требований (например, под воротами может оставаться пролет для легкого открывания створок в зимнее время).
  2. Быстрая установка. При наличии опорных столбов (если, например, выполняется замена ворот), монтаж занимает всего несколько часов. Если ворота устанавливаются одновременно с забором, наши специалисты обеспечивают проведение всех необходимых работ в кратчайшие сроки.
  3. Большой выбор конструкций ворот. Мы предлагаем распашные ворота различных конструкций, а также разной высоты. Благодаря этому у наших клиентов всегда есть возможность подобрать оптимальный вариант с учетом их требований, а также особенностей участка и подъездной зоны.

Калитки из профнастила

В компании «МегаЗабор» вы можете заказать не только ворота распашные из профнастила, но и металлические калитки. При необходимости такая калитка может быть установлена в любой части забора. Мы устанавливаем калитки с комплектом качественной фурнитуры, причем помимо петель и щеколд могут быть установлены ручки, врезные замки и т.п.

Как заказать забор или калитку?

Для этого вам достаточно связаться с нашими сотрудниками. Мы организуем выезд замерщиков на место, рассчитаем для вас стоимость калитки или забора, выполним не только поставку, но и установку распашных конструкций. Обращаясь в «МегаЗабор», вы получаете качественное и комплексное обслуживание на максимально удобных условиях!

И калитки, и ворота изготавливаются из качественного и прочного профнастила с антикоррозийным покрытием. Створки могут окрашиваться в любой цвет по желанию заказчика, а их конструкция иметь дополнительное усиление в виде поперечных или диагональных балок.

Мы предлагаем нашим клиентам не только прочные, но и удобные в использовании ворота и калитки — они легко открываются в любое время года, долго служат, не требуют дополнительного ухода. Все это становится возможным благодаря тому, что мы не используем дешевых материалов и обеспечиваем высокое качество работ по установке заборов. При этом цена таких конструкций, а также монтажных работ остается доступной. У нас вы сможете заказать калитку или забор недорого и не сомневаясь при этом в их качестве. Звоните!

Откатные ворота из профнастила и профлиста,цена с установкой под ключ.»Русский Забор».

Цена на автоматические откатные ворота из профнастила с установкой 

Свайно-винтовой фундамент включает в себя 2 сваи d 108 с заглублением до 2,5 м.  Оборудование — откатные системы Ролтэк. Столбы проема 60х60х2 — 2 штуки. Автоматика NICE, R-TECH, CAME. Обшивка из профлиста.

Ворота из профнастила — ширина проема в мм Ширина проёма в мм / цена руб
3000 3500 4000

1800

83000 руб 84500 руб 86000 руб
2000  85000  86500 88000
 2200  86000 87500 89000
2500 87000 88500 90000
3000 90000 91500 93000

Цена на автоматические откатные ворота из профнастила с установкой на монолитный фундамент

Параметры фундамента: длина 2000х1500х500 мм (длина-глубина-ширина).  Оборудование — откатные системы Ролтэк. Столбы према ворот 60х60х2 — 2 штуки. Автоматика NICE, R-TECH, CAME. Обшивка из профлиста.

Откатные ворота — высота проема в мм Ширина проёма в мм / цена руб
3000 3500 4000
1800 93000 руб 94500 руб 96000 руб
2000 95000 96500 98000
2200 96000 97500 99000
2500 97000 98500 100000
3000 100000 101500 105000

Автоматические откатные ворота из профнастила — схема

Забор с откатными воротами из профнастила смотрится красивой и законченной конструкцией, удобной в использовании.  Обшивка чаще всего изготавливаются из профнастила с профилем С8, С20, С21. 

  1. Рама изготавливается из стальной профильной трубы 60х30, 60х40, 60х60, 80х80 мм. Обрешетка ворот изготавливается из стальной профильной трубы 20х20 или 40х20 мм. Консольная часть выполняется в виде прямоугольника, либо в виде диагонали.
  2. Откатные ворота из профнастила могут быть укомплектованы автоматикой Итальянской фирмы NICE, CAME, R-TECH мощность которых зависит от веса и размера конструкции, и двумя дистанционными пультами. При неоходимости можно заказать дополнительные пульты. 
  3. Усиление рамы производится с помощью монтажа дополнительных 4-х или 6-ти диагоналей в периметре ворот (диагонали изготавливаем из профильной трубы 40х20, 60х30, 60х40 мм) и дополнительной диагонали в консольной части, что увеличивает жесткость всей конструкции ворот до 60%. Это усиление увеличивает срок службы ворот в 2 раза.
  4. Цена комплекта указана с отделкой из профнастила с лицевой стороны стандартных расцветок — коричневый, зеленый, бордовый с установкой.  Продажа откатных ворот без установки тоже возможна. 
  5. Откатные ворота класса Стандарт — имеют в основании сваи d 108 мм, каркас ворот окрашен эмалью по металлу Тиккурила или Хаммерайт, наполнение каркаса — профнастил классических цветов с лицевой стороны.
  6. Откатные ворота класса Эконом —  имеют в основании сваи с d 108, каркас ворот окрашен грунтом по металлу серого или коричневого цвета, наполнение каркаса из любого материала —  за дополнительную оплату.

По желанию заказчика возможно изготовление ворот с частичной комплектацией. Из стоимости исключается обшивка и автоматика, которые заказчик может впоследствии установить самостоятельно. Автоматику можно купить в нашей компании. Также можно заказать откатные вороты из профнастила с встроенной или отдельно стоящей калиткой или с элементами ковки.

Заказ можно разместить на электронной почте [email protected], или позвонив по многоканальному телефону +7 (495)135-57-65 или операторам, которые примут заказ в устной форме. Оформленный договор и смету мы вышлем на вашу электронную почту, а оригиналы привезем на замер или монтаж.

схемы, расчет, фото и видео монтажа

Готовые качественные ворота стоят дорого, поэтому можно попробовать изготовить их своими руками. Один из лучших вариантов для обшивки створок — профлист. Это гофрированный металлический облицовочный стройматериал из оцинкованной холоднокатаной стали с защитным полимерным слоем.

Оглавление:

  1. Плюсы и минусы профлиста
  2. Сравнение популярных видов покрытий
  3. Классификация и маркировка
  4. Схема устройства ворот
  5. Габаритные параметры
  6. Технология монтажа своими руками

Достоинства и недостатки обшивки ворот профнастилом

Преимущества:

  • огнестойкость;
  • небольшой вес — проще транспортировка и установка;
  • устойчивость к перепадам температур и выцветанию под воздействием ультрафиолета;
  • простой монтаж — сделать может и человек, не имеющий опыта;
  • не сыреет, не подвержен появлению сколов и трещин, не требует ремонта;
  • срок службы до 50 лет;
  • не нужен сложный уход, достаточно время от времени смывать с поверхности пыль водой из шланга.

Недостатки:

  • возможность коррозии;
  • при сильном механическом воздействии (удар) появляются вмятины.

Выбор профнастила для ворот

Подбирают по следующим параметрам:

  • Форма профиля. Волна, трапеция или синусоидная.
  • Высота. Cоставляет от 8 до 158 мм.
  • Дизайн. Виды отделки: однотонный цветной, под камень, под кирпич или древесину.
  • Одно- или двухсторонняя отделка. Декоративный слой может быть нанесен с одной или обеих сторон. Особенно подходит двусторонний вариант, но нужно учитывать, что его цена выше.
  • Толщина стали. Для ворот и калитки — не тоньше 0,7 мм.
  • Толщина оцинкования. У качественного материала — от 180 до 275 г/м2. Если он ниже, то профнастил намного быстрее разрушится от коррозии.
  • Толщина и тип полимерного покрытия. Чем больше его слой, тем долговечнее. Но качество защиты прежде всего зависит от того, какой именно вид полимеров использован для ее создания.

Сравнительная характеристика популярных полимерных покрытий:

Параметр Пурал (полиуретан) Матовый пурал PVDF Пластизол Матовый полиэстер Глянцевый полиэстер
Срок службы, лет 50 50 35 30 15 10
Толщина слоя, мкм 50 50 27 200 35 25 — 28
max t эксплуатации, °С 100 100 110 60 120 120
min t обработки, °С -15 -15 -10 10 -10 -10
Прочность, по 3 бальной шкале 2 2 1 3 1 1
Устойчивость к коррозии 3 3 3 3 2 2
Устойчивость цвета 2 2 3 2 3 1

Виды профнастила и маркировка

Маркировка состоит из букв, означающих его тип, и цифр, указывающих на высоту профиля в миллиметрах, например, Н-75.

  • С — стеновой. Толщина профнастила — от 0,4 мм, высота — от 8, средний вес — 4,5 кг. Это самый легкий вид, для монтажа ворот или забора его лучше не использовать.
  • НС — несуще-стеновой. Толщина — от 0,5 до 0,8 мм, высота — от 8, средний вес — от 7 до 14 кг/м2. Оптимальный вариант для обшивки ворот и калитки.
  • Н — несущий. Самый прочный, между волнами находятся специальные борозды для увеличения жесткости. Толщина — до 1,2 мм, высота — до 158, вес — до 24 кг/м2. Выбирая именно этот тип для створок распашных ворот, нужно учитывать, что из-за их тяжести петли прослужат меньше.

Помимо плит обычной прямоугольной формы подходят фигурные с волнообразным краем с одной стороны. Стандартная ширина — от 800 до 1200 мм, длина может быть разной — от 500 мм.

Конструкция ворот с обшивкой из профилированного листа

Предварительно составляют эскиз с точными размерами. Сначала определяют их конфигурацию. Часто помимо основных створок есть калитка для пешеходов — встроенная в одну из дверей или отдельностоящая. Первый вариант стоит дешевле.

По схеме работы ворота бывают двух видов:

  • Распашные. Их створки открываются внутрь или наружу, крепятся к опорам специальными петлями.
  • Раздвижные (откатные). Их двери перемещаются параллельно забору вправо или влево. Есть два варианта механизма раздвижения: консольный и рельсовый. Первый тип предпочтительнее, особенно зимой, но стоимость его выше. У консольных между ними и грунтом остается зазор (дорожный просвет), у рельсовых его нет.

Распашные намного дешевле откатных, если делать их самому.

Для более удобного пользования и исключения необходимости приложения силы человека на створки ставят автоматические приводы. Для распашных дверей подходят два их вида: рычажный (до 400 кг) и линейный (до 500). Автоматика для механизмов раздвижения выдерживает вес до 2 т, может оснащаться дистанционным управлением.

Основные детали ворот с калиткой:

  • Опоры. Делают из металла или дерева. Часто облицовывают кирпичом, он сам по себе не способен нести нагрузку и выполняет лишь декоративную функцию.
  • Каркасы дверей и калитки. Рамы сваривают из металлического уголка или профиля с размерами от 40х20 мм и толщиной стенок от 1,5 мм. Реже используют ковку.
  • Обшивка из профнастила.
  • Запирающий механизм. Это специальные засовы, щеколды, замки: врезные, накладные, редко навесные, кодовые, электромеханические. Для откатных и распашных ворот подходят разные запирающие механизмы. Различают также замки для открывания внутрь или наружу, лево- и правосторонние. Изделия из нержавеющей стали самые надежные.
  • Петли для дверей или механизм раздвижения.
  • Петли для калитки.

Опорные столбы

Для изготовления металлических конструкций берут профиль, швеллер или трубу любой формы с толщиной стенок от 5 мм. Размеры подбирают в зависимости от веса дверей: до 150 кг — от 8х8 см, от 150 до 300 — от 10х10, от 300 — от 14х10.

Кирпичные типы обычно имеют ширину 1,5, реже — в 2 кирпича. Диаметр трубы для основы подбирают с учетом расстояния между его внутренними кирпичными стенками. Оно зависит от выбранного размера сечения опоры. Если она будет в 1,5 кирпича, то подойдет труба диаметром до 12 см. Первые ряды лучше обустраивать из полнотелого кирпича. Для фиксации элементов применяют цементно-песчаный раствор. В швы по периметру прокладывают арматуру. Со стороны створок распашных ворот в процессе выполнения кладки монтируют закладные детали для повышения прочности столба и крепления петель. Закладные делают из металлического уголка и приваривают их к трубе с помощью пластин. Первую закладную устанавливают на уровне около 30 см от фундамента. Поверх готовых конструкций ставят оголовки из бетона или металла для защиты от механических воздействий, осадков и в качестве украшения.

Деревянные опоры самостоятельно изготавливают из бруса с сечением не менее 100х100 мм. Самый прочный вариант — дубовая балка.

Размеры ворот

При составлении чертежа учитывают:

  • Габариты автомобилей, которые будут проезжать через проем. Для свободного проезда необходимо расстояние, равное ширине машины плюс 1 м. Для раздвижных видов учитывают, что прибавляется запас на откат. Ширина дверей конструкций с распашным механизмом не должна превышать 2 м. Если нужны створки большего размера, то ставят дополнительные петли. Ширина калитки обычно — от 80 до 110 см.
  • Высоту забора. Размер должен соответствовать высоте ворот.
  • Требуемую высоту дорожного просвета (расстояние от несущей балки до земли). У распашных оптимальный размер составляет 10—15 см, у откатных зазор допустимо делать меньше, зимой снег не мешает их открыванию.

Самостоятельная установка ворот

Сделать распашные конструкции с калиткой, обшитые профилированным листом, можно следующим образом:

1. Выполнить чертеж с точными размерами.

2. Вырыть по схеме ямы. Дно лунок должно находиться ниже уровня промерзания грунта, иначе столбы зимой начнут выпирать из почвы. Обычно это около 1,5 м, но для каждого региона эту цифру нужно выяснять более точно.

3. Насыпать в ямы щебень (можно вторичный) слоем толщиной до 30 см.

4. Поместить в лунки каркас из нескольких прутьев арматуры, расположенных вертикально и горизонтально, связанных в виде сетки.

5. В ямы установить опоры из металла или бруса. Проверить их высоту натянутым шнуром, вертикальность — уровнем.

6. Заполнить лунки обычным бетонным раствором. Пока он не застынет (в течение около 14 дней), периодически проверять вертикальность. Если опоры будут из кирпича, то затем выполняют кладку.

7. Болгаркой (угловой шлифовальной машиной) с отрезным диском по металлу нарезать по чертежу из профиля детали для каркасов створок и калитки. При этом учесть, что раму для обеих дверей сначала делают целой. На две части ее режут после крепления к столбам.

8. Прихватить проволокой к опорам боковые элементы рам. Если они из кирпича, то этот пункт пропустить.

9. Прикрепить к опорам петли. Повесить на них боковины рам на болты или приварить.

10. Приварить к боковым элементам каркаса дверей верх и низ рамы.

11. Прикрепить к обрешетке по центру поперек две детали вертикально. Оставить между ними щель шириной 5 мм.

12. Сварить раму калитки. Если выбрана встроенная, то прикрепить ее на петли к одной из створок, если самостоятельная, то рядом с воротами к опоре.

13. Горизонтально поперек рам дверей и калитки приварить для усиления еще одну деталь. Убрать прихватки из проволоки.

14. Разрезать каркас для дверей угловой шлифовальной машиной (болгаркой) на две части.

15. Проверить петли, несколько раз открыв и закрыв двери.

16. Покрыть готовую обрешетку антикоррозийной грунтовкой и покрасить, лучше под цвет профнастила.

17. Обшить раму. Для крепления применяют саморезы.

Резать профнастил болгаркой нельзя. Для этого используют дисковую пилу, ножовку или ножницы по металлу простые или высечные, дрель с насадкой Сверчок, высечные или шлицевые электроножницы. Если инструмент не понадобится впоследствии, то оптимальный вариант — ножовка. Если же работы по резке металлических листов будет много, то можно приобрести один из видов электроножниц, самое лучшее качество реза — у шлицевых.

Легкие ворота из профнастила для дачи — монтаж своими руками — sdelayzabor.ru

Стальной профилированный лист – материал легкий и практичный, да и выглядит он презентабельно. Поэтому из профлиста многие домовладельцы строят дачные заборы, калитки и ворота. Подобные решения удачны своей простотой и приемлемой стоимостью, особенно если хозяин решит все работы выполнить собственноручно. Для этого нужны 3 вещи: желание, наличие инструментов и знание технологии строительства, о чем пойдет речь далее.

Ворота на дачу из профнастила

Определение размеров и конструкции ворот

Для изготовления створок своими руками первым делом нужно определиться с шириной проема. Она зависит от габаритов транспорта, въезжающего во двор. На этот счет есть такие рекомендации:

  1. Минимальная ширина проезда для легкового автомобиля – 2,5—2,6 м.
  2. Габарит грузового транспорта, в том числе импортного, не превышает 2,5 м. Исключение – крупногабаритная спецтехника (экскаваторы, бульдозеры, тракторы). Размер въезда для грузовиков должен быть не менее 3,5 м.
  3. Если лицевое ограждение находится на узкой улочке или перекрестке, то автомобилю понадобится больше места для поворотного маневра и въездной проем надо увеличить на 0,5—1,5 м в зависимости от условий.
  4. Не стремитесь без необходимости делать слишком большие ворота. Маленькие створки прослужат дольше, да и по цене обойдутся дешевле.
  5. Высота открывающейся части принимается не меньше размера примыкающего забора.

Схема ворот и калитки из профнастила с двухсторонней обшивкой

Оптимальный вариант компоновки ворот – это 2 створки одинакового размера, открывающиеся внутрь двора. Калитка обособляется и делается рядом с въездом либо ставится отдельно, на некотором расстоянии. Если встроить входную дверь в одну из створок по гаражному способу, то срок службы сооружения сократится из-за постоянного раскачивания.

Конструктивно ворота для дачи, изготавливаемые своими руками из металлопроката и профнастила, состоят из следующих основных элементов:

  • опорная часть — столбы и фундаменты;
  • металлические каркасы створок;
  • полотна (внешняя обшивка), в данном случае – профлист.

Для их изготовления нужно подобрать стальной прокат оптимального сечения, чтобы обеспечить надежность сооружения и не переплатить за стройматериалы.

Какие материалы выбрать?

Существует много разновидностей металлопроката, пригодного для строительства ворот. Наиболее приемлемый вариант как с точки зрения надежности, так и цены изделий, — профильные трубы.

Разнообразие профильных труб из нержавеющей стали

Если ширина проема составляет 3,5 м, а высота ограждения – до 2,5 м, то с учетом веса профнастила на изготовление конструктивных элементов своими руками пойдет прокат такого сечения:

  • на столбы – профиль 100х80 мм (минимум), а лучше – 100х100 мм с толщиной стенки не менее 5 мм;
  • на каркас и раскосы – профильная труба 60х40 мм со стенкой 3 мм;
  • на козырьки опор – стальной лист толщиной 2 мм.

Отдельный вопрос – выбор марки и толщины профлиста для обшивки стальных каркасов своими руками, с подбором цвета затруднений у вас не возникнет. Маркировка этих изделий расшифровывается так:

  1. Первая буква указывает на тип листа: С — стеновой, Н – кровельный, НС – универсальный.
  2. Вторая цифра – это высота гребней профиля в миллиметрах.
  3. Цифра через тире – модульная (полезная) ширина листа (в мм).
  4. Длина и толщина изделий в маркировке не отражается.

Ворота принято обшивать стеновым листом с невысоким профилем марок С8 — С20. Модульная ширина большого значения не имеет, поскольку у всех производителей она примерно одинакова – 0,9—1,2 м. Подойдет и марка НС, но ее стоимость выше. Профлист для кровли с высокими гребнями покупать не стоит, он существенно дороже, да и не подходит по внешнему виду.

Выбор профнастила по толщине заключается в том, чтобы не купить слишком тонкий металл, который прогибается пальцем. На рынке встречаются изделия толщиной 0,3—0,35 мм, что абсолютно не приемлемо. Вас устроит толщина не менее 0,5 мм.

Порядок ведения работ

Сборка и монтаж ворот своими руками выполняется в несколько этапов:

  • определение точек установки столбов;
  • монтаж и бетонирование опор;
  • заготовка и резка металлопроката по размерам;
  • сборка каркасов створок;
  • крепление полотен из профлиста;
  • навешивание створок.

Если забор на даче строился раньше, чем ворота, то стойки для них уже готовы и первые 2 этапа выполнять не нужно. В противном случае надо тщательно вымерять и обозначить места, где планируется монтировать столбы. Дальнейшую технологию стоит рассмотреть подробнее.

Установка столбов

Монтаж опор для ворот своими руками производится в такой последовательности:

  1. Нарезать трубы для столбов. Длина рассчитывается так: высота ограждения плюс нижний проем 30—50 мм плюс подземная часть, составляющая не менее 1/3 от общей длины.
  2. Выкопать яму диаметром 30—40 см. Глубина принимается из расчета, что 1/3 часть стойки будет в земле, но не менее 1 м.
  3. Дно ямы утрамбовать, засыпать 10 см щебня и снова уплотнить.
  4. Вставить опору в яму, выровнять по вертикали в 2 плоскостях и зафиксировать. Перед этим для надежности производится анкеровка столба – приварка к поземной части подошвы и кусков арматуры.
  5. Приготовить бетон марки М200 (к 1 части цемента М400 добавляется 2,5 части песка и 4,2 части щебня) и залить его в яму.

Нагружать опоры допускается после полного застывания бетона – спустя 28 дней, а за это время можно изготовить сами ворота и сделать их облицовку из профнастила. Если планируется калитку ставить вплотную к воротам, то вместо 2 стоек придется забетонировать 3.

Изготовление створок

Створки изготавливаются своими руками в виде стальных рам из профильных труб, свариваемых встык. Перед этим важно точно определить и нанести на чертеж размеры полотен, чтобы при открывании они не цеплялись за землю (зазор 3—5 см) и четко сходились между собой с минимальным зазором. Технология сборки такая:

  1. Нарезать профильные трубы согласно размерам по чертежу.
  2. Разложить заготовки на ровной площадке таким образом: рамка, горизонтальная перемычка посередине и 2 раскоса для жесткости – сверху и снизу.
  3. Пользуясь угольником, соединить прихватками все детали каркаса, кроме раскосов. Горизонтальную перемычку прихватить в створе между вертикальными стойками и заподлицо и с ними.
  4. Измерить 2 диагонали рамки. Если их длина разная, то раму нужно выровнять вручную, после чего прихватить раскосы.
  5. Качественно проварить все швы и зачистить их болгаркой.
  6. Приварить щеколды и закладные под установку замка.

Перед монтажом профлиста будущие ворота следует загрунтовать и окрасить в желаемый цвет. Пока краска высыхает, нужно своими руками порезать профнастил под габариты створок. При этом верх полотна можно сделать фигурным, используя электролобзик. Крепление к раме осуществляется саморезами либо самосверлящими винтами. Чтобы красиво выделить верхнюю границу полотна, на него следует надеть крашеный П-образный профиль из тонкого металла.

Окончательный монтаж ворот

Готовые створки с обшивкой из профлиста необходимо навесить на столбы, действуя вместе с помощником в такой последовательности:

  1. Используя подставки и подпорки, установить створки вплотную к опорам, связав их между собой проволокой.
  2. Выверить полотна по вертикали и убедиться в наличии зазоров снизу.
  3. Сваркой прихватить петли к столбам и проверить, насколько хорошо открываются ворота. Убедиться, что при закрывании они не соприкасаются рамами и стоят на одном уровне.
  4. Окончательно приварить петли своими руками, проверить работу створок еще раз.
  5. Нанести на столбы и навесы 2 слоя краски, предварительно покрыв их грунтовкой ГФ-021.

Чтобы ворота на даче надежно запирались, нужно поставить на калитку замок и подогнать щеколды. Для ригелей замка можно вырезать отверстия прямо в профильной трубе, а для запирания щеколд забетонировать в землю круглые трубы. Более современный вариант – поставить автоматические электроприводы открывания створок.

 

 

Ворота из профилированного листа: материалы, конструкции, последовательность действий

Ворота из профнастила устанавливают на дачном участке, в элитном поселке или на открытой автостоянке, при въезде в гараж или ангар. Рассмотрим достоинства и недостатки используемого полотна, классические конструктивные решения, их особенности и технологию монтажа. После прочтения статьи вопросов по обустройству въезда в крытый гараж, на автостоянку или через ограждение участка практически не останется. 

Гофрированные полотна из оцинкованной сталиИсточник 1c-bitrix-cdn.ru

Обзор технических характеристик профлиста

Профнастил – это гофрированная тонколистовая сталь с оцинкованным защитным покрытием. Дополнительно для придания цвета или рисунка наносится слой из полимерного состава с одной или двух сторон. В продажу поступает материал трех классов: C. CH. H. Различия заключаются в высоте волны, прочностных показателях, толщине полотна и массе (по нарастающей соответственно перечислению). Для ворот допустимо использование всех типов несущего профлиста, но всё же чаще предпочитают дополнительно усиленные.

К плюсам устройства заборов из профлиста и калитки, и ворот относят следующее:

  • легкий вес; 
  • достаточно высокая жесткость; 
  • легкий раскрой; 
  • быстрота сборки конструкции; 
  • долговечность результата; 
  • сохранение внешнего вида в течение длительного времени, возможность его менять; 
  • эстетичность.  

Из недостатков стоит отметить слабую механическую устойчивость к ударам и прочим механическим воздействиям. Полотна деформируются или образуются сквозные повреждения. В результате нарушается защита от коррозии, которую необходимо будет обновить.
 

Деформация профлиста от удараИсточник www.shumoekran.ru

Еще один минус – металл не заглушает звуки. А малый вес листов вынуждает прибегать к усилению и утяжелению каркаса с опорными столбами. Это обосновано тем, что сплошным полотнам конструкции дополнительно нужно будет сопротивляться переменчивым воздушным потокам. 

Конструкции ворот

Ворота устанавливают в месте для проезда на автомобиле. Это может быть часть забора или строения (гараж, ангар, крытая автостоянка). Выбор конструктивного решения базируется на способах управления створками и наличии либо отсутствии встроенной калитки для забора из профнастила. 



Распашные

Классический вариант исполнения – ворота с двумя одинаковыми створками. Также допустимо навешивание одного полотна или разной ширины (на усмотрение владельца). Они навешиваются на опорные столбы на цилиндрические петли. Управление воротами осуществляется вручную или с помощью механизмов с электроприводом и дистанционным пультом. 

Распашные воротаИсточник msmlux.ru

К достоинствам подобного решения относят простоту монтажа, минимальное количество комплектующих. К недостаткам можно отнести необходимость в свободном пространстве для створок. Особенно этот вопрос актуален для регионов со снежными зимами.

Распашные со встроенной калиткой

В целях экономии свободного пространства нередко калитку из профлиста размещают в одной из створок ворот. Однако в этом случае важно продумать каркас, чтобы не перешагивать через нижнюю перекладину. Если часто ходить через калитку вы не планируете, то разделять направляющую не обязательно. 

Откатные

Откатные ворота нуждаются в свободном пространстве по бокам для установки рельсовых направляющих. Они должны быть расположены в одной плоскости со створками. Такая конструкция актуальна для плотно застроенных участков, где места для створок распашного типа недостаточно. Управление откатными воротами обычно осуществляется автоматизированно.

Откатные ворота Источник www.ivd.ru

Среди массы достоинств откатной конструкции отмечается необходимость в строгих расчетах для установки роликовой системы и устройству опор. Кроме того, срок службы ниже, чем у классического исполнения. А на строительные работы уходит больше материалов, времени и денежных средств. 

Иные решения

К таковым относятся навесные конструкции с верхней перекладиной. Она способствует сохранению положения столбов в заданном положении, но может стать помехой для проезда высоких автомобилей и специализированной техники. Также рассматривается вариант кованых ворот. Это роскошь, высокая прочность и оригинальность, авторский дизайн.  

Размеры

Ширину въездной зоны определяют габаритами машины с учетом выступающих зеркал. Дополнительно рекомендуется брать запас в 100 см для маневров или проезда более крупной техники. Как правило, в итоге получается 3-5 м. Для калитки оставляют 0,9-1,2 м для свободного прохода двух людей среднего телосложения. 

Ворота с калиткой, расположенной рядом Источник landshaftdizajn.ru

Высота, как правило, аналогична длине профлиста. Так, если полотно имеет размер 2 м, то ворота из профнастила с калиткой приподнимают на 20-50 см над землей для защиты кромки листа от осадков и растительности. На заказ некоторые изготовители предлагают разные варианты с шагом 0,5 м. 

Смотрите в видео варианты красивых заборов из профнастила:

Столбы

Материалом для опорных элементов может служить металлический профиль квадратного или круглого сечения, деревянный массив. Первый вариант считается более надежным и долговечным решением. Как правило, это труба со стенками 3мм, поперечным сечением около 80 мм. Заготовки предварительно обрабатывают антикоррозионным составом длительного действия, который защищает металл при прямом контакте с грунтом.

Установка проводится на глубину не менее ⅓ от общей длины столба, но ниже уровня промерзания почвы. Заготовки должны иметь строго вертикальное положение. Для надежности дно лунки (ширина равна трем диаметрам столба) укрепляют утрамбованной насыпью из щебня с песком слоем 15-30 см. Остальное пространство заполняют цементным раствором (то же делают с полостью в профиле, если отсутствует верхняя герметичная заглушка). Стенки ямы рекомендуется укрыть рубероидом для защиты бетона.
 

Схема устройства опорной конструкцииИсточник kuprnn.ru

Забор из профнастила: выбор подходящего материала, и основные этапы монтажа

Дополнительно опорные элементы можно задекорировать. Это может быть кирпичная кладка или обшивка с имитацией природных материалов. В таком случае будет заужен въездной пролет, поэтому в проекте нужно учитывать размеры готовых столбов заранее. 

Каркас

Для каркаса ворот из профлиста применяется металлический профиль квадратного или прямоугольного сечения. Это могут быть заготовки размером 40*20 или 60*40 мм, – какую использовать, зависит от расчётов ветровой нагрузки. Для перемычек можно использовать трубы 20*20 мм. Толщина может составлять 2-3 мм.

Торцевой разрез проводится под прямым углом или в 45 градусов. Второй вариант увеличивает площадь сварного шва, что положительно сказывается на прочности соединения. Электроды, как правило, берут диаметром в 3 мм.

Усиление створок осуществляется посредством перемычек. Их приваривают горизонтально, по диагонали либо перекрестно. Дополнительно по периметру можно закрепить уголки из листового железа.

На готовой конструкции сварные швы зачищают и шлифуют. Всю конструкцию обезжиривают и покрывают грунтовочным составом. В завершение каркас окрашивают ЛКМ с антикоррозионными добавками.
 

Готовый каркас к обшиванию Источник abgate.ru

Профнастил для забора: виды, характеристики, особенности выбора

Последовательность действий

Установка столбов проводится с применением бетонного раствора, на высыхание которого уходит не менее 28 дней. В результате проведение работ по монтажу ворот возможно не ранее, чем через 14 суток, чтобы набор прочности составлял минимум 50%.

Сначала приваривают петли (2 или 3 в зависимости от веса конструкции и нагрузки на ворота). Лучше использовать гаражные петли, так они справляются с высокой механической нагрузкой и долго служат. Расположение выбирается с учетом отступа от горизонтальных направляющих дверцы на 20-30 см. Для одностороннего открывания петли накладывают на опору и раму, для двухстороннего – монтируют встык к столбу.

Далее приступают к фиксации профнастила. Для этого используют кровельные саморезы с уплотнительными герметичными шайбами. Вкручивают их во все элементы каркаса, включая перемычки. Шаг равен ширине двух волн. Нахлест полотен проводится на 1 выступ.
 

Расположение крепежа Источник images.ru.prom.st

В завершение монтируется дополнительная фурнитура. К ней относятся замки, крючки и шпингалеты с ответными проушинами, ручки и механизмы для автоматизированного управления створками. Подобные детали нуждаются в периодической чистке, смазывании или окрашивании антикоррозионными составами. 

Смотрите в видео пошаговую сборку ворот из профнастила:

Забор из кирпича и профнастила: особенности и выбор материала, этапы строительства

Коротко о главном

Профилированное полотно стенового типа из тонколистовой стали мало весит, долго служит и справляется с высокими механическими нагрузками со стороны ветра, что актуально для устройства заборов и ворот с калитками.

Ворота и калитка из профнастила строят на каркасе из металлопрофиля. Опираются створки на столбы. Управление может быть ручным или автоматизированным.

Конструктивное исполнение может быть представлено одной или двумя створками распашного или раздвижного типа. Калитку либо отдельно располагают, либо встраивают в ворота.
 

Главные раздвижные ворота из алюминиевого профиля, сталелитейный завод Vaishnu

Главные раздвижные ворота из алюминиевого профиля, металлургический завод Vaishnu | ID: 12424634412

Спецификация продукта

Открытый стиль

1

Высота
Высота 6 FT
Материал Алюминий
Страна Происхождение Сделано в Индии
Гарантия 5 месяцев

Заинтересованы в этом товаре?Уточнить цену у продавца

Связаться с продавцом

Изображение продукта


О компании

Год основания1986

Юридический статус фирмы Физическое лицо — Собственник

Характер деятельностиПроизводитель

Количество сотрудников от 11 до 25 человек

Годовой оборотRs. 1–2 крор

IndiaMART Участник с октября 2008 г.

GST03AEHPG1646P1ZF

Мы «Vaishnu Steel Works» добились успеха на рынке благодаря производству высококачественного ассортимента дверных проемов из кованого железа, перил из кованого железа, перил из кованого железа, парапетов из кованого железа , и т.д. Мы — известная и надежная компания, которая была зарегистрирована в 1986 году по адресу Ludhiana (Пенджаб, Индия) и разработала хорошо функциональную и просторную инфраструктурную единицу, где мы производим эти продукты эффективным способом.Мы являемся Индивидуальным Предприятием, которым управляет наш наставник «г-н. Нареш Гоял», , и приобрели огромную клиентуру по всей стране.

Видео компании

Вернуться к началу

1

Есть потребность?
Лучшая цена

1

Есть потребность?
Лучшая цена

Мелинда Френч Гейтс — Фонд Билла и Мелинды Гейтс

Мелинда Френч Гейтс — филантроп, деловая женщина и глобальный защитник прав женщин и девочек. В качестве сопредседателя Фонда Билла и Мелинды Гейтс она формирует и утверждает стратегии фонда, анализирует результаты и определяет общее направление деятельности организации. Она работает с грантополучателями и партнерами для достижения цели фонда по улучшению справедливости в Соединенных Штатах и ​​во всем мире.

Работая в фонде более двух десятилетий, Мелинда воочию убедилась, что расширение прав и возможностей женщин и девочек может привести к кардинальному улучшению здоровья и благосостояния семей, сообществ и общества.Ее работа побудила ее все больше внимания уделять гендерному равенству как пути к значимым изменениям.

Наша роль заключается в том, чтобы идти на риск, который, если он окупится, может дать миллионам людей шанс максимально использовать свою жизнь.

Мелинда Френч Гейтс

Сопредседатель и попечитель

Мелинда также является основателем Pivotal Ventures, инвестиционной и инкубационной компании, работающей над социальным прогрессом для женщин и семей в Соединенных Штатах, и она является автором бестселлера Момент подъема , который знакомит читателей с вдохновляющих женщин, которых она встретила во время своей работы и путешествует по миру, и делится своим собственным путем к тому, чтобы стать защитником прав женщин и девочек.

Мелинда, вторая из четырех детей, выросла в Далласе, штат Техас. Она получила степень бакалавра компьютерных наук и экономики, а также степень магистра делового администрирования в Университете Дьюка. Она провела первое десятилетие своей карьеры, разрабатывая мультимедийные продукты в Microsoft, прежде чем покинуть компанию, чтобы сосредоточиться на своей семье и благотворительной деятельности.

У нее трое детей, Дженн, Рори и Фиби, и она живет в Сиэтле, штат Вашингтон.

Государственный парк каньона Золотые Ворота — Парки штата Колорадо

Посетители каньона Золотые Ворота ищут утешения в очищающей природе Скалистых гор.Однако когда-то этот безмятежный парк был центром промышленности Колорадо. Смелые предприниматели прибыли в поисках золота в середине 1800-х годов, а свежие ручьи снабжали нелегальные винокурни во время сухого закона.

12 пешеходных и велосипедных маршрутов в парке часто пересекаются и охватывают более 35 миль, что позволяет составить индивидуальный маршрут во время путешествия по осиновым лесам, полевым цветам, лугам и густым хвойным лесам. Другими выдающимися особенностями вдоль системы троп являются остатки усадеб ранних поселений и 360-градусный вид на альпийские вершины Колорадо.

Панорама-Пойнт Живописная смотровая площадка — одна из самых популярных смотровых площадок в парке. До этой популярной достопримечательности, до которой можно добраться на машине или пешком, открывается вид на Континентальный водораздел, простирающийся на 160 км. Карта на обзорной площадке помогает определить такие знаковые вершины, как гора Эванс и пик Лонгс. Любимый способ добраться до Панорамы — Тропа оленя-мула, умеренная пешеходная и велосипедная тропа, которая ведет через поля с дикими цветами, осиновые рощи и широкие склоны холмов — не забудьте свою камеру для этой идеальной сцены.

Волшебный момент в государственном парке каньона Золотые Ворота

Вдали от городских огней в государственном парке «Золотые ворота каньона» наблюдение за звездами выходит на новый уровень. Переночуйте в одной из юрт, домиков или полностью оборудованных кемпингов и уединенных мест в бэккантри парка. Кемпинг — один из лучших способов познакомиться со всеми чудесами второго по величине государственного парка Колорадо.

Каньон Золотые Ворота внесен в наш список 99 великолепных мест в Колорадо. Посмотрите, что еще попало в список >>

Продлите поездку

Historic Downtown Golden, Central City Opera, Indian Springs Resort, Mount Evans Scenic & Historic Byway, Gaming in Colorado: Lady Luck живет в Cripple Creek, Central City и Black Hawk

Ближайшие города

Айдахо-Спрингс, Голден, Блэк Хок, Централ Сити, Денвер

Хотите больше?

Узнайте больше о парках штата Колорадо >>

Взгляните и на наши национальные парки >>

Фотографии: Авторские права flickr/Янн Ропарс; авторское право flickr/Янн Ропарс; любезно предоставлено Colorado Parks & Wildlife.

Внеклеточные ворота формируют энергетический профиль экспортера ABC

Abstract

Экспортеры ABC используют энергию АТФ для перекачивания субстратов через мембраны. Открытие и закрытие внеклеточных ворот являются ключевыми этапами транспортного цикла, но основной механизм плохо изучен. Здесь мы создали синтетическое однодоменное антитело (sybody), которое распознает гетеродимерный экспортер ABC TM287/288 исключительно в присутствии АТФ, что было необходимо для решения проблемы 3.2 Å кристаллическая структура обращенного наружу переносчика. sybody связывается с внеклеточным крылом и сильно ингибирует активность АТФазы, сдвигая конформационное равновесие транспортера в сторону обращенного наружу состояния, как показано с помощью двойного электрон-электронного резонанса (DEER). Мутации, которые облегчают открытие внеклеточных ворот, приводят к сравнимому сдвигу равновесия и сильно снижают активность АТФазы и транспорт лекарств. Используя sybody в качестве конформационного зонда, мы демонстрируем, что эффективное закрытие внеклеточных ворот необходимо для диссоциации димера NBD после гидролиза АТФ, чтобы вернуть транспортер обратно в его обращенное внутрь состояние.

Тематические термины: Биохимия, Структурная биология

Введение

ABC-экспортеры представляют собой универсальные мембранные белки, обнаруженные во всех типах жизни. Экспортеры типа I являются наиболее изученным классом экспортеров ABC и состоят как минимум из двух трансмембранных доменов (TMD), каждый из которых включает шесть трансмембранных спиралей и два домена связывания нуклеотидов (NBD), которые универсально консервативны среди всех транспортеров ABC. NBD претерпевают большие конформационные изменения в ответ на связывание и гидролиз АТФ, которые передаются в TMD через спирали связывания, чтобы принять конформацию, обращенную внутрь (IF), обращенную наружу (OF) и закрытую наружу (Occ) конформацию 1 .Чередующийся доступ к TMDs в сочетании с изменениями аффинности к транспортируемым субстратам делает возможным восходящий транспорт через липидный бислой 2 . Полностью закрытые NBD стабилизируются двумя молекулами АТФ, связанными на поверхности димера, и совпадают с TMD, принимающими состояние OF или Occ 3 , 4 . Переход в состояние IF требует, чтобы NBD по крайней мере до некоторой степени разделялись, процесс, который инициируется гидролизом АТФ 5 .

Многие экспортеры ABC, включая все семейство ABCC человека, демонстрируют асимметричные сайты связывания АТФ, а именно вырожденный сайт, который может связывать, но не гидролизовать АТФ, и консенсусный сайт, который является компетентным в отношении гидролиза 6 . Гетеродимер ТМ287/288 термофильной бактерии Thermotoga maritima был первым структурно проанализированным примером АВС-экспортера с вырожденным сайтом 7 , 8 . Две близкородственные структуры IF TM287/288 были решены с помощью рентгеновской кристаллографии, либо они содержали одну молекулу AMP-PNP, связанную с вырожденным участком, либо не содержали нуклеотида.В отличие от большинства других структур IF экспортеров ABC, открытые NBD TM287/288 лишь частично разделены из-за контактов, опосредованных D-петлей вырожденного сайта, тогда как D-петля консенсусного сайта аллостерически связывает связывание АТФ в вырожденный сайт к гидролизу АТФ в консенсусном сайте 8 . Консенсусный сайт имеет искажения в мотиве Walker B, что предотвращает связывание нуклеотидов в транспортере IF 7 . Исследования DEER показали, что TM287/288 демонстрирует динамическое равновесие IF/OF в присутствии нуклеотидов и что захват нуклеотидов в консенсусном сайте необходим для сильного заселения состояния OF, тогда как в присутствии AMP-PNP транспортер преимущественно принимает свою IF. штат 9 .

Распространение на большие расстояния было обнаружено DEER во внеклеточных воротах TM287/288, что указывает на конформационную гибкость в этой внешней области 9 . Аналогичные наблюдения были зарегистрированы для ABCB1 10 . Беспристрастное моделирование молекулярной динамики (МД) TM287/288 выявило спонтанные конформационные переходы из состояния IF через промежуточное соединение Occ в состояние OF 11 . Многие симуляции оставались в ловушке в состоянии Occ, указывая на то, что открытие внеклеточных ворот представляет собой главный энергетический барьер в конформационном цикле. Интересно, что степень открывания внеклеточных ворот сильно различается у различных ABC-экспортеров типа I в состоянии OF, тогда как ворота остаются закрытыми в состоянии Occ 3 , 4 , 12 . Следовательно, события, происходящие во внеклеточных воротах, вероятно, играют ключевую роль в транспорте субстрата и должны быть аллостерически связаны с каталитическим циклом NBD. Тем не менее, лежащий в основе молекулярный механизм неизвестен.

В этой работе мы создали однодоменные антитела, которые связываются исключительно с OF TM287/288 и тем самым ингибируют транспортный цикл.Связующие были инструментальными для решения кристаллической структуры транспортера в его состоянии OF и использовались для исследования молекулярных событий во внеклеточных воротах и ​​их аллостерической связи с NBD.

Результаты

Конформационное улавливание TM287/288

Решив две близкородственные IF-структуры TM287/288, наша цель состояла в том, чтобы получить атомную структуру этого гетеродимерного ABC-экспортера в его состоянии OF. Анализы DEER показали, что TM287/288, несущий мутацию TM288 E517Q в мотиве Walker B консенсусного сайта (мутация EtoQ), был почти полностью захвачен в состоянии OF в присутствии ATP-Mg или ATPγS-Mg 9 .Чтобы еще больше снизить остаточную АТФазную активность мутанта EtoQ (оборот 0,02 мин -1 ) в 6,5 раза, вместо этого мы ввели мутацию EtoA. Кроме того, мы создали однодоменные антитела (нанотела), которые распознают исключительно состояние OF TM287/288. С этой целью альпак иммунизировали OF TM287/288, содержащим мотив сшитого тетраспирального пучка 13 (см. Методы). Этот подход привел к связыванию нанотела Nb_TM#1 исключительно с TM287/288 в присутствии (но не в отсутствие) АТФ, как показано с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (рис.). Однако кристаллы, полученные с Nb_TM#1, дифрагировали недостаточно хорошо, чтобы построить достоверную модель. Поэтому мы выбрали синтетические нанотела (ситела) против TM287/288(EtoA) в присутствии АТФ-Mg полностью in vitro 14 . Таким образом, было создано более десяти OF-специфических sybody, и sybody Sb_TM # 35 было успешно использовано для определения структуры OF TM287/288 (EtoA) в присутствии ATPγS-Mg с разрешением 3,2 Å (рис., дополнительная таблица 1). ).

Три обращенные наружу структуры TM287/288 в комплексе с фрагментами однодоменных антител.Транспортеры просматриваются вдоль плоскости мембраны (обозначены серым прямоугольником). a 3,2 Å структура TM287/288 (EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и специфичным для состояния sybody Sb_TM#35. b 3,5 Å структура TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#1, зависящим от состояния. c 4,2 Å кристаллическая структура TM287/288 (2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#2, не зависящим от состояния. d SPR-анализы в отсутствие (верхняя панель) и в присутствии (нижняя панель) АТФ с использованием иммобилизованного TM287/288 (EtoQ) в качестве лиганда и Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2 в качестве аналитов. Вводимые концентрации Sb_TM#35: 0, 9, 27, 81, 243, 729 нМ; Nb_TM#1: 0, 1, 3, 9, 27, 81 нМ; Nb_TM#2: 0, 0,9, 2,7, 8,1, 24,3, 72,9 нМ. Кинетический анализ показан в дополнительной таблице 2

Структура комплекса TM287/288-sybody

Sybody Sb_TM#35 связывается на вершине внеклеточного крыла TM287/288 (рис. ) и играет решающую роль в установлении контактов с кристаллами ( Дополнительный рис. 1 ). Связывание опосредуется ароматическими остатками всех трех областей, определяющих комплементарность (CDR) sybody, которые зажаты между трансмембранными спиралями (TM) 1 и 2 TM287 и TM 5′ и 6′ TM288 (фиг.). Поскольку Sb_TM#35 связывается только в присутствии АТФ (рис. ), мы предположили, что он мешает каталитическому циклу переносчика. Действительно, sybody ингибировал АТФазную активность TM287/288 в детергенте (IC 50 из 66,1 нМ, рис. ), а также восстанавливался в нанодисках (дополнительный рисунок  2b ). Следует отметить, что ингибирование было менее эффективным в нанодисках, предположительно из-за нарушения доступности эпитопов sybody в контексте мембраны.

sybody перехватывает TM287/288 в состоянии OF. a Sybody Sb_TM#35 показан серым цветом, а CDR1, 2 и 3 выделены желтым, оранжевым и красным цветом соответственно. Четыре ароматических остатка (Y33, W52, Y59 и W113), которые вклиниваются между TM 1 и 2 TM287 (бирюзовый) и TM 5′ и 6′ TM288 (пурпурный), выделены палочками. b Ингибирование гидролиза АТФ TM287/288 с помощью Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC 50 , а также остаточной активности.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. c , d DEER-анализ пар спин-меток, введенных для исследования внеклеточных и внутриклеточных TMD и NBD ( c ), а также связывания sybody с транспортером ( d ). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА с немеченым Sb_TM#35 или без него ( c ) или в присутствии АТФ-ЭДТА и спин-меченого Sb_TM#35 ( d ). На графиках показаны экспериментальные распределения расстояний, а вертикальные пунктирные линии, показанные в c  , показывают изменения средних расстояний

Два нанотела, адресующие эпитопы на NBD

Использование структуры высокого разрешения OF TM287/288 для молекулярной замены и в качестве шаблона для при построении модели мы решили две дополнительные структуры с низким разрешением (3.5–4,2 Å) транспортера ОФ, определенного в комплексе с нанотелами альпаки Nb_TM#1 и Nb_TM#2 (рис. ). Nb_TM#1 специфически распознает состояние OF и связывается с нижней частью закрытого димера NBD, занимая эпитоп, общий для NBD287 и NBD288 (рис. ). Было обнаружено, что сродни Sb_TM # 35, Nb_TM # 1, специфичный для состояния, ингибирует АТФазную активность транспортера (рис. ). Nb_TM#2 связывается сбоку с NBD288 и проявляет пикомолярное сродство к транспортеру независимо от того, присутствует АТФ или нет (рис., Дополнительная таблица 2 ). Тем не менее, это нанотело частично ингибирует активность АТФазы примерно на 30% уже при самой низкой исследованной концентрации 20 нМ (рис.  ). Поскольку для надежного измерения активности АТФазы концентрация TM287/288 должна составлять не менее 8 нМ, мы не смогли определить значение IC 50 для Nb_TM#2. Артефакт измерения можно исключить, поскольку неродственное контрольное тело не влияло на АТФазную активность транспортера (рис. ).

Переход от IF к OF делает TM287/288 более симметричным

Структура OF TM287/288 включает полностью димеризованные NBD, которые образуют сэндвич между двумя молекулами ATPγS-Mg в вырожденном и консенсусном сайтах (рис., Дополнительный рис. 3 ). Почти идентичная структура (RMSD 0,21 Å) была также получена в присутствии АТФ-Mg (дополнительный рисунок 4c , дополнительная таблица 1 ). В отличие от NBD IF TM287/288, которые демонстрировали выраженную асимметрию между вырожденным и консенсусным сайтом, в основном в отношении D-петлей 8 , закрытый димер NBD транспортера OF более симметричен (рис. , Дополнительный Рис. 3 ). Кроме того, искажения, обнаруженные в каталитической паре консенсусного сайта структуры IF (E517 TM288 и H548 TM288 ), релаксируют во время перехода в состояние OF, и два ключевых остатка принимают расположение, способное к гидролизу (рис.). Интересно, что в консенсусном сайте присутствуют два туннеля, которые позволили бы высвобождать расщепленный γ-фосфат (рис. ). TMD, состоящие из двух крыльев, каждое из которых включает шесть трансмембранных спиралей, полученных от обоих протомеров, широко открыты наружу (дополнительный рисунок 4 ). При среднеквадратичном отклонении 1,73 Å структура TM287/288 больше всего напоминает структуру Sav1866. Кроме того, структура OF аналогична конформации OF TM287/288, предсказанной моделированием MD (дополнительный рис. 5 ) 11 , хотя в МД-моделировании белок был встроен в липидный бислой вместо детергентной среды, используемой для кристаллизации. Также степень закрытия NBD и открытия внеклеточных ворот очень похожа между TM287/288 и Sav1866 (дополнительный рисунок 6a ). СКО между TM287 и TM288 уменьшается с 2,55 Å до 1,98 Å по мере того, как транспортер преобразуется из конформации IF в OF, что указывает на то, что OF TM287/288 более симметричен (дополнительный рис. ). В то время как аналогичная степень симметрии наблюдалась между полутранспортерами OF ABCB1 (PDB: 6C0V, RMSD 2,07 Å), эквивалентные суперпозиции демонстрируют существенную асимметрию в структуре OF MRP1 (PDB: 6BHU, RMSD 4,54 Å), в основном из-за асимметрии TMD (дополнительный рисунок 6b ). Открытие внеклеточных ворот менее выражено в MRP1 и еще менее выражено в ABCB1, и ворота остаются почти полностью закрытыми в окклюзированной наружу структуре McjD 4 (дополнительный рис. ). Следовательно, структуры экспортеров OF и Occ ABC демонстрируют наибольшую структурную изменчивость во внеклеточных воротах.

Структурный анализ закрытого димера NBD. a Полностью закрытый димер NBD (NBD287 бирюзового цвета и NBD288 пурпурного цвета) размещает две молекулы ATPγS-Mg (показаны в виде палочек с соответствующей электронной плотностью) между мотивом Walker A (красный) и противоположным мотивом сигнатуры ABC (зеленый) в вырождены, а консенсусный сайт высокосимметричен. Остатки, участвующие в связывании и гидролизе АТФ, показаны палочками. b Наложение согласованного сайта связывания АТФ ранее решенной структуры IF (PDB: 4Q4A, светло-розовый) и структуры OF (пурпурный). Искажения каталитической диады (E517 TM288 и H548 TM288 ) ослабляются во время закрытия NBD, чтобы принять компетенцию гидролиза. Боковая цепь E517 TM288 была смоделирована в структуру TM287/288(EtoA). c Срез двух сайтов связывания нуклеотидов показывает два возможных выходных туннеля P и в консенсусном сайте, которых нет в вырожденном сайте.ATPγS (частично вырезанный) показан в виде желтых палочек

sybody действует как молекулярный зажим

Интересно, что мы не обнаружили стерических столкновений, которые препятствовали бы связыванию Sb_TM#35 с транспортером IF. Следовательно, основываясь только на структурной информации, мы не могли объяснить, почему sybody ингибирует активность АТФазы. Поэтому мы использовали спектроскопию DEER, чтобы выяснить влияние тела на конформационный цикл.

Было обнаружено, что sybody смещает равновесие транспортера в сторону состояния OF, что измерялось в присутствии АТФ-ЭДТА (стрелки на рис.). Выраженные эффекты наблюдались во внеклеточной области (54 TM287 /290 TM288 и 54 TM287 /271 TM287 ), а также при зондировании на расстоянии во внутриклеточной области ВНЧС (131 98873 TM2 TM288 ) и в НБД (460 TM287 /363 TM288 ) (рис. и дополнительный рисунок  7 ). Кроме того, мы наблюдали увеличение расстояния между двумя спиновыми метками, расположенными в крыле под корпусом (54 TM287 /290 TM288 ) в результате связывания корпуса (пунктирные вертикальные линии на рис.). Это говорит о том, что sybody действует как клин при раскрытом внеклеточном крыле. Как и ожидалось из-за отсутствия связывания sybody с состоянием IF, мы наблюдали незначительное влияние на межспиновые расстояния, когда TM287/288 инкубировали с sybody в отсутствие нуклеотидов (состояние апо) (дополнительный рисунок 7 ).

Чтобы исследовать расположение связанного sybody относительно противоположного крыла, мы затем сосредоточились на расстоянии между sybody, помеченным в позиции 71, и спиновыми метками, введенными либо в 54 TM287 (крыло, связывающее sybody), либо в 271 TM287. (противоположное крыло) транспортера (рис.и дополнительный рисунок 8 ). Пик основного расстояния, соответствующий дипольной связи между 71 Sb_TM#35 и 54 TM287 , был очень острым и с центром на 3,8 нм, в то время как между 71 Sb_TM#35 и 271 TM28173 он был несколько шире и с центром на 3,2 нм. разместили на противоположном крыле. Оба расстояния были видны только в присутствии АТФ и хорошо согласовывались с моделированием, основанным на структуре OF (дополнительный рисунок 8 ).Обе кривые также содержали пик расстояния около 5,2 нм, соответствующий остаточной доле димеров sybody в растворе. В заключение, sybody действует как молекулярный зажим, удерживающий внеклеточные ворота открытыми.

Законсервированные аспартаты запечатывают внеклеточные ворота

Показав, что sybody захватывает транспортер в полностью открытом состоянии, мы пришли к выводу, что мутации, способствующие открытию внеклеточных ворот, будут иметь аналогичное влияние на энергетический ландшафт транспортера.В ИФ TM287/288, D41 TM287 и D65 TM288 , помещенных в TM1 соответствующего полутранспортера, устанавливаются водородные связи с амидами основной цепи противоположного крыла (рис. ). Следует отметить, что эти аспартаты сохраняются у бактериальных экспортеров ABC (рис. ), но не у эукариотических членов семейства. Когда аспартаты были заменены аланинами, АТФазная активность TM287/288 снизилась примерно в три раза для одиночных мутантов и примерно в 10 раз для двойных мутантов (далее называемых мутантами 2xDtoA) (рис.).

Внеклеточные ворота закрыты двумя законсервированными аспартатами. a Структура внеклеточных ворот TM287/288 в состоянии IF (слева, PDB: 4Q4H) и OF (справа), показанная на рисунке. D41 TM287 и D65 TM288 показаны в виде палочек и устанавливают водородные связи (желтые пунктирные линии) с пептидным остовом (показаны в виде палочек) соседних спиралей TM6 и TM6′, которые разрываются во время перехода IF-OF. b Выравнивание последовательностей бактериальных экспортеров ABC в области, содержащей консервативные аспартаты внеклеточных ворот. c АТФазная активность одиночных мутантов D41A TM287 и D65A TM288 и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа определена в детергенте. d Стимулируемая лекарственным средством АТФазная активность EfrEF дикого типа, одиночных мутантов D41A EfrE и D50A EfrF и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA), восстановленных в протеолипосомы, определенная в отсутствие (базовая активность) или в присутствии этидия в указанных концентрациях.Данные нормализовали к базовой АТФазной активности соответствующего мутанта. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. e Накопление этидия в клетках Lactococcus lactis , экспрессирующих EfrEF дикого типа, неактивный мутант Walker B E515Q EfrF или внеклеточные гейт-мутанты D41A EfrE и D50A EfrF или соответствующий двойной DxD мутант . f DEER анализирует внеклеточные и внутриклеточные TMD и NBD (те же позиции, что и на рис.). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА для транспортера дикого типа и для TM287/288 (2xDtoA). г Относительная АТФазная активность мутанта 2xDtoA в присутствии возрастающих концентраций Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC 50 , а также остаточной активности. Столбики погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических трех повторов

Используя снова АТФ-ЭДТА для индуцирования перехода IF в OF, анализ DEER выявил сдвиг равновесия в сторону состояния OF в мутанте 2xDtoA для всех спин-меченых пар (рис. и дополнительный рисунок 9 ). Сдвиг равновесия был аналогичен сдвигу, вызванному Sb_TM#35. Следовательно, аспартаты во внеклеточных воротах представляют собой энергетический барьер, который необходимо преодолеть, чтобы переключиться в состояние OF и повлиять на АТФазный цикл в дальнодействующей аллостерической связи, соединяющей внеклеточные ворота с NBD.

Чтобы изучить атомные детали конформационной динамики, лежащей в основе перехода IF-OF, мы выполнили МД-моделирование TM287/288 в липидном бислое POPC, начиная с кристаллической структуры IF (PDB: 4Q4A), после стыковки второго ATP-Mg молекулы в консенсусный сайт 11 и введение мутаций 2xDtoA во внеклеточные ворота.Как и в наших предыдущих MD-симуляциях TM дикого типа 287/288 11 , мы наблюдали спонтанные крупномасштабные конформационные переходы от конформации IF через состояние Occ к конформации OF; этот полный переход наблюдался в 3 из 20 независимых симуляций 500 нс (дополнительный рисунок 10 ). Несмотря на ограниченную статистику, переход происходит несколько чаще, чем у дикого типа (6 из 100 симуляций 11 ), что согласуется с нашими экспериментальными результатами и представлением о том, что полярные контакты двух остатков аспартата повышают энергетический барьер открытия внеклеточных ворот.Хотя МД-моделирование и экспериментальные данные согласуются, мы не можем исключить различные результаты, если эти довольно продолжительные моделирования проводились в липидном бислое, содержащем другие липиды, такие как, например, POPE 15 . Чтобы оценить стабильность структуры OF, о которой сообщается в этой работе, было проведено 20 независимых 400-нс симуляций как для дикого типа, так и для мутанта 2xDtoA. Хотя sybody не присутствует в моделировании, конформация OF с двумя связанными молекулами АТФ-Mg очень стабильна и просто колеблется вокруг рентгеновской структуры (дополнительный рис. 11 ). Дополнительное контрольное моделирование в бислое POPE (вместо POPC) подтвердило этот результат (дополнительный рисунок 11 ), что делает маловероятным то, что состав липидов (с точки зрения головных групп PC и PE) оказывает большое влияние на АТФ-Mg. -связанная структура OF.

Затем мы ввели мутации 2xDtoA в гетеродимерный экспортер ABC EfrEF Enterococcus faecalis (рис. ) 16 . Было обнаружено, что стимулированные этидием профили АТФазной активности восстановленного мембраной EfrEF сильно зависят от одиночных мутаций DtoA, и АТФазная активность EfrEF, содержащего мутации 2xDtoA, больше не может стимулироваться лекарственным средством (рис.). Подтверждая это мнение, мутант TM287/288 (2xDtoA), восстановленный в нанодисках, демонстрировал сильно сниженную стимуляцию лекарственными препаратами Hoechst 33342 (дополнительный рисунок 2a ). Затем мы экспрессировали мутанты EfrEF дикого типа и DtoA в Lactococcus lactis и отслеживали поглощение этидия с помощью измерений флуоресценции (рис. ). EfrEF дикого типа эффективно вытесняет этидий из клетки, что приводит к медленному увеличению накопления этидия, которое достигает низкого стационарного уровня. EfrEF, содержащий мутацию EtoQ в NBD, служил в качестве отрицательного контроля, демонстрируя высокие уровни накопления этидия 17 . Одиночные мутанты DtoA D41A EfrE и D50A EfrF частично утратили способность к оттоку этидия. Интересно, что кривая накопления мутанта 2xDtoA не достигает стационарного уровня в пределах временных рамок эксперимента. Это наблюдение предполагает дефект транспортера, приводящий к пассивному притоку этидия в клетку, опосредованному EfrEF, несущему мутации 2xDtoA. В заключение, внеклеточные аспартаты являются важными остатками-привратниками, которые аллостерически связаны с NBD и необходимы для транспорта субстрата.

Внеклеточный гейт-мутант и sybody проявляют синергизм

Поскольку как связывание sybody, так и ослабление внеклеточного гейта сдвигают конформационное равновесие в сторону состояния OF, мы пришли к выводу, что эти эффекты являются аддитивными. Действительно, при IC 50 18,4 нМ (рис. ) ингибирование TM287/288, несущего мутации 2xDtoA, с помощью Sb_TM#35 оказалось более выраженным, чем ингибирование транспортера дикого типа (IC 50  = 66,1 нМ) (рис.  ). Кроме того, аффинность Sb_TM#35 к мутанту 2xDtoA ( K D  = 14 нМ) была примерно в восемь раз выше, чем к транспортеру дикого типа (K D  = 110 nM) Инжир. 12 , дополнительная таблица 2 ). Аффинность также увеличивалась при введении мутации EtoA или EtoQ в консенсусный сайт транспортера ( K D  = 66 нМ), который также демонстрировал сдвиг конформационного равновесия в сторону состояния OF 9 и был самый высокий для комбинированного тройного мутанта (2xDtoA/EtoA) ( K D  = 8 нМ). Аналогичная картина наблюдалась для Nb_TM#1, который связывается с закрытым димером NBD.IC 50 была значительно меньше при исследовании мутанта 2xDtoA ( K D  = 16,8 нМ) по сравнению с TM287/288 дикого типа ( K D  0= . Это различие снова отражалось увеличением аффинности для мутанта 2xDtoA (37 нМ) по сравнению с транспортером дикого типа ( K D  = 184 нМ), а самая высокая аффинность наблюдалась для тройного мутанта ( K D  = 5 нМ) (дополнительный рисунок 12 , дополнительная таблица 2 ). В заключение, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 связываются с противоположными концами транспортера, но, тем не менее, демонстрируют очень сходное биофизическое поведение при захвате транспортера OF.

Исследование преобразования OF-IF с помощью связывающих веществ, специфичных для состояния

Наконец, мы проверили, могут ли нанотела, зависящие от состояния, использоваться в качестве зондов в SPR для исследования перехода OF-IF TM287/288. Когда иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали АТФ-Mg и затем промывали буфером, не содержащим нуклеотидов, максимальный сигнал связывания SPR для связывающих веществ, специфичных для состояния OF, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 медленно уменьшался в течение временного окна в несколько часов (рис.). Иммобилизованный TM287/288 был стабилен в течение этого времени, потому что максимальный сигнал связывания для неспецифического состояния нанотела Nb_TM#2 лишь незначительно уменьшился (рис. ). Впоследствии мы исследовали конверсию OF-IF с использованием либо АТФ-Mg (гидролизующие условия), либо АТФ-ЭДТА (связывание АТФ без гидролиза).

Проверка перехода OF-IF с помощью связывателей, зависящих от состояния. a Примеры необработанных данных следов SPR, на основе которых было обнаружено конформационное зондирование. В нулевой момент времени иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали 1 мМ АТФ (красная стрелка) и вводили связующие вещества (серые стрелки) в насыщающих концентрациях (Sb_TM#35, 1 мкМ; Nb_TM#1, 500 нМ; Nb_TM# 2, 100 нМ) для получения максимальных значений единиц ответа (RU max ) в указанные моменты времени. b RU max значения для дикого типа и мутантных TM287/288 были получены, как показано в a , путем зарядки транспортера 1  мМ АТФ либо в присутствии Mg 2+ (верхняя панель), либо ЭДТА (нижняя панель). Для связующих веществ Sb_TM#35 и Nb_TM#1, зависящих от состояния, данные подгоняли с использованием функции однофазного распада для определения значений периода полураспада ( t 1/2 ) состояния OF. Неспецифический для состояния Nb_TM#2 использовали в качестве контроля

В случае TM287/288 дикого типа, загруженного АТФ-Mg или АТФ-ЭДТА, связывающие вещества, специфичные для состояния, не смогли распознать транспортер в пределах временного разрешения эксперимент, показывающий быстрое преобразование в состояние IF.Напротив, состояние OF было долгоживущим, когда ATP-Mg окклюзировался EtoQ или мутантом EtoA. Время жизни в состоянии OF, определяемое специфическими для состояния связующими веществами Sb_TM#35 или Nb_TM#1, было очень сходным ( t 1/2 из 45 или 49 минут для мутанта EtoQ и 287 или 268 минут для EtoA). мутант соответственно). Поразительно, но эти значения хорошо согласуются с периодом полураспада АТФ, гидролизованного этими мутантами, а именно 32 мин (мутант EtoQ) и 205 мин (мутант EtoA) при 25°С. Для тех же мутантов ситуация была обратной для АТФ-ЭДТА.Мутант EtoA легко превращался в состояние IF, аналогичное транспортеру дикого типа, тогда как состояние OF было очень стабильным для мутанта EtoQ ( t 1/2  = 112 или 95 мин соответственно). В этом случае АТФ не может гидролизоваться, и мы исследуем диссоциацию NBD со связанной АТФ (но без координации Mg 2+ ). Глутамин в мотиве Walker B, по-видимому, стабилизирует связывание АТФ в сэндвич-димере NBD, тогда как канонический глутамат или аланин в том же положении способствуют быстрой диссоциации NBD.При введении мутаций 2xDtoA состояние OF было очень долгоживущим в случае АТФ-ЭДТА ( t 1/2  = 297 или 281 мин соответственно). Это говорит о том, что ослабление внеклеточных ворот мутациями 2xDtoA сильно препятствует диссоциации NBD, тогда как диссоциация NBD транспортера дикого типа в этих экспериментальных условиях происходит очень быстро. Открытие NBD еще больше замедляется, если мутации 2xDtoA сочетаются с мутацией EtoA как для АТФ-Mg, так и для АТФ-ЭДТА.

Из этого набора данных можно сделать два основных вывода. Во-первых, гидролиз АТФ ослабляет димер NBD и необходим для сброса транспортера в состояние IF в физиологических условиях, где всегда присутствуют АТФ и Mg 2+ . И, во-вторых, сильные контакты на внеклеточных воротах необходимы для оказания механической силы на NBD, чтобы облегчить быстрое открытие NBD, чтобы сбросить транспорт обратно в его IF-состояние.

Обсуждение

В этой работе мы раскрыли возможности однодоменных антител, специфичных для состояния, полученных от альпак и полностью in vitro из синтетических библиотек, для исследования мембранного переносчика на структурном и функциональном уровне.Стратегия создания специфических для штата биндеров против экспортеров ABC типа I имеет долгую историю, уходящую в 90-е годы прошлого века, когда было идентифицировано специфическое для штата ABCB1 антитело UIC2 18 . Недавняя крио-ЭМ структура ABCB1 в комплексе с UIC2 показала, что антитело зажимает внеклеточные петли вместе, тем самым предотвращая открытие внеклеточных ворот 19 . Молекулярный зажим закрытых внеклеточных ворот был также достигнут с помощью циклического пептида, индуцированного против CmABCB1 20 . Другими примерами связующих, которые предотвращают превращение IF-OF, являются нанотела, образующиеся против ABCB1 и PglK, которые оба стерически конфликтуют с закрытием NBD 21 , 22 . Напротив, наши связующие специфичны для состояния OF и, следовательно, препятствуют превращению OF-IF.

Связывание Sybody с внеклеточным крылом TM287/288 было необходимо для решения структуры OF. И вырожденный, и консенсусный сайт связывания АТФ полностью закрыты и высокосимметричны, но только консенсусный сайт несет каталитическую диаду, расположенную для катализа гидролиза АТФ 23 .Это говорит о том, что гидролиза АТФ только одного нуклеотида достаточно, чтобы инициировать диссоциацию NBD. В подтверждение этой точки зрения закрытые димеры NBD имеют два возможных выходных туннеля P и в консенсусном сайте.

Сравнение с другими транспортными структурами OF и Occ выявило значительную конформационную гетерогенность в степени открытия внеклеточных ворот, которая, как обсуждалось, играет потенциальную роль в выдавливании субстратов или предотвращении повторного связывания субстратов 3 , 4 , 10 , 12 , 24 . В этом исследовании мы раскрываем перекрестные помехи между внеклеточными воротами и циклом АТФазы, связь, которая, насколько нам известно, еще не исследована на молекулярном уровне (рис. ). sybody, стабилизирующий открытое внеклеточное крыло, или мутации, ослабляющие внеклеточные ворота, смещают конформационное равновесие в сторону состояния OF. Предыдущие экспериментальные и вычислительные исследования показали, что закрытие NBD предшествует открытию внеклеточных ворот во время перехода IF-OF 11 , 25 , а анализ DEER показал, что открытие внеклеточных ворот может быть частичным, когда NBD закрывается полностью 9 , 10 , 26 .Следовательно, по-видимому, существует встроенный механический принцип, согласно которому открытие внеклеточных ворот требует больших энергетических затрат. И наоборот, используя наши нанотела, зависящие от состояния, в качестве конформационных зондов, мы смогли показать, что закрытие внеклеточных ворот связано с диссоциацией закрытого димера NBD после гидролиза АТФ. Наши эксперименты с EfrEF продемонстрировали, что плотно закрытые внеклеточные ворота на самом деле имеют решающее значение для функции транспортера. Кроме того, мутант 2xDtoA имел сильно сниженную активность АТФазы и утратил способность стимулироваться лекарственными препаратами.Это указывает на то, что закрытие внеклеточных ворот стало лимитирующей стадией каталитического цикла мутанта 2xDtoA. Следовательно, у этого мутанта превращение IF-OF больше не ограничивает скорость и, следовательно, не может стимулироваться связыванием лекарственного средства с направленным внутрь высокоаффинным сайтом (Fig. ).

Роль внеклеточных ворот в транспортном цикле TM287/288. Субстрат (желтая звезда) связывается с транспортером IF (1) с высокой аффинностью, в то время как внеклеточные ворота закрыты двумя аспартатами (закрытый D-замок).Связывание и окклюзия двух молекул АТФ-Mg на интерфейсе NBD приводит к переходу в состояние OF (2). Внеклеточные ворота открываются (открытый D-замок) и высвобождается субстрат. Внеклеточные ворота пустой обращенной наружу полости закрываются (3) и, таким образом, могут запускать гидролиз АТФ в консенсусном сайте. Механическая сила прочно закрытых внеклеточных ворот (закрытый D-замок) необходима для диссоциации NBD после гидролиза АТФ, чтобы вернуть транспортер в его состояние IF

Состояние OF, связанное с АТФ, с полностью закрытыми NBD упоминается как высокоэнергетическое состояние транспортного цикла, и в некоторых случаях предполагалось, что гидролиз АТФ необходим для заполнения состояния OF вообще 10 , 26 .Напротив, мы и другие ранее установили, что связывания АТФ достаточно для превращения IF-OF и высвобождения субстрата 9 , 11 , 27 , в соответствии с моделью переключения АТФ 28 . Следует отметить, что в то время как открытые внеклеточные ворота действительно представляют высокоэнергетическое состояние, в действительности верно обратное для закрытого димера NBD. Он принимает низкоэнергетическое состояние, и для диссоциации димера 29 требуется большое количество энергии.Частично это достигается гидролизом АТФ 30 , 31 . Важно отметить, что наши результаты предполагают, что диссоциация NBD также включает механический компонент, опосредованный закрытием внеклеточных ворот. Еще одной возможностью является запуск гидролиза АТФ в результате закрытия внеклеточных ворот. Хотя это спекулятивно и напрямую не подтверждается и не исключается нашими данными, такой механизм гарантирует, что транспортер возвращается в состояние IF только после высвобождения субстрата.

Почему и когда гидролиз АТФ необходим для достижения активного транспорта, является постоянным предметом споров в области транспортеров ABC. Наши данные, представленные здесь и в предыдущих исследованиях 9 , 11 , ясно указывают на то, что только связывание АТФ (в случае АТФ-ЭДТА, когда гидролиз АТФ не может происходить) достаточно для конверсии IF-OF и, предположительно, для активного транспорта одна молекула субстрата. Затем направленность транспорта достигается за счет переключения аффинности сайта связывания субстрата, который неизбежно подвергается радикальным перестройкам, когда TMDs переключаются с IF на OF конформацию 12 .Тем не менее, маловероятно, что ABC-экспортер может эффективно работать только за счет связывания и диссоциации АТФ, потому что не хватает энергии, и молекулярные события будут управляться только медленными стохастическими броуновскими движениями. Чтобы сильно заселить состояние OF в физиологических условиях, ATP-Mg должен быть окклюзирован в консенсусном сайте закрытого димера NBD 32 , состояние, которое может быть эффективно имитировано мутацией Walker B EtoQ или EtoA 33 .Как мы показываем здесь с помощью наших зондов-биндеров, окклюзия АТФ прочно захватывает транспортер в состоянии OF и предотвращает цикличность транспортера. Следовательно, гидролиз АТФ, по-видимому, строго необходим для инициации диссоциации закрытого димера NBD. Как только АТФ гидролизуется, сила, создаваемая закрытыми внеклеточными воротами, облегчает диссоциацию NBD. Таким образом, наши результаты подтверждают представление о том, что гидролиз АТФ необходим для управления транспортным циклом на этапе сброса из состояния OF в состояние IF.

Мы надеемся, что наши результаты обеспечат механистическую основу для дальнейшего изучения функциональной роли внеклеточных ворот экспортеров ABC типа I и изучения молекулярной основы болезнетворных мутаций, обнаруженных во внеклеточной области важных с медицинской точки зрения экспортеров ABC, таких как MRP1. и CFTR 34 , 35 .

Методы

Экспрессия и очистка

Гены, кодирующие гетеродимерный транспортер ABC TM287/288, были амплифицированы и клонированы в pINIT_cat (addgene: Plasmid #46858) 7 . Гены были субклонированы. ; 36 для кристаллизации и биохимических анализов в вектор экспрессии pBXNh4L или в вектор экспрессии pBXNh4LCA для получения биотинилированных вариантов TM287/288 14 .

Свежетрансформированные клетки MC1061 E. coli выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100  мкг/мл ампициллина до OD 600 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017 % (масса/объем) L-арабинозы в течение 5 часов при 30 °C. Собирали клетки и готовили клеточные мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина. Мембраны солюбилизировали добавлением 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозида (β-DDM, Glycon) в течение 2 ч при 4°С.Солюбилизированные мембраны были дополнены 20 мМ имидазолом и загружены в самотечную колонку Ni-NTA Superflow (Qiagen) при 4 °C, промыты 20 объемами колонки 50 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об./об.) глицерина. и 0,03 % (мас./об.) β-DDM или 0,3 % (мас./об.) н-децил-β-D-мальтозида (β-DM, Glycon) и элюировали 4 объемами колонки 200 мМ имидазола, рН 7,5, 200 мМ NaCl. , 10 % (об./об.) глицерина и 0,03 % (вес./об.) β-DDM или 0,3 % (вес./об.) β-DM с последующим обессоливанием с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17–0851–1 ) уравновешивают 20 мМ Tris-HCl pH7. 5, 150 мМ NaCl и 0,03 % (масса/объем) β-DDM или 0,3 % (масса/объем) β-DM. Метку His 10 отщепляли в течение ночи при 4 °C с использованием 3 C протеазы (1:10 масс./масс.) с последующей повторной загрузкой на колонку Ni-NTA с гравитационным потоком, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 40 мМ имидазола и 0,03 % (масса/объем) β-ДДМ или 0,3 % (масса/объем) β-ДМ при 4°С. Обработанный TM287/288 полировали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0.03 % (мас./об.) β-DDM или 0,3 % (мас./об.) β-ДМ при 4 °C и концентрируют до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 50 кДа. Очищенные варианты TM287/288 использовали сразу или мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при -80 °C.

Avi-меченые варианты TM287/288 были ферментативно биотинилированы с использованием BirA во время расщепления при 3 C в 20 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об. /об.) глицерина, 10 мМ ацетата магния и 0,03 % (вес./об.) β-ДДМ и двукратный молярный избыток биотина.

EFREF был усилен из геномной ДНК Enterococcus Faecalis V583, клонируется в шаттл вектор PREXNH4 через FX клонирование 36 и субклонированные в экспрессию Вектор PNZ8048NH4 через векторный магистраль Exchange Cloning (VBEX) 37 37 . Трансформированные Л. Лактис NZ9000 ΔLMRAΔLMRCD Клетки 38 38 38 38 были выращены в среде M17, дополненные 0,5% глюкозы и 5 мкг / мл хлорамфеникола к OD 600 от 1 при 30 ° С, а экспрессию вызвало добавление низинсодержащего культурального супернатанта 90×115 л.lactis NZ9700 в течение 4 ч (1:5000 [об./об.]). Собирали клетки и готовили мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина 16 . EfrEF очищали с использованием β-DDM таким же образом, как и TM287/288 (см. выше).

Нанотела/ситела были либо экспрессированы из pSb_init (добавочный ген: #110100) для биохимических экспериментов, либо субклонированы в pBXNPHM3 (дополнительный ген: #110099) путем клонирования FX для получения нанотел/сител без меток для кристаллизации и экспериментов DEER 14 , 36 .Очищенные нанотела и синтела хранили при температуре -80 °С.

Мутагенез

Для ослабления внеклеточных ворот два консервативных аспартата были заменены аланинами в различных вариантах TM287/288, что привело к TM287/288(2xDtoA). D41A TM287 вводили с помощью праймеров TM287_D41A_FW (GGC ACG TAT TGT CGC CGA AGG AAT CG C) и TM287_D41A_RV (GCG ATT CCT TCG GCG ACA ATA CGT GCC). D65A TM288 вводили с использованием праймеров TM288_D65A_FW (CAT AGG AAA AAC GAT CGC TGT TGT CTT CG) и TM288_D65A_RV (CGA AGA CAA CAG CGA TCG TTT TTC CTA TG).Чтобы сделать TM287/288 каталитически неактивным, E517A TM288 вводили в TM287/288 и TM287/288 дикого типа (2xDtoA) с использованием праймеров TM288_E517A_FW (CCT GAT ACT GGA CGC AGC CAC CAG CAA C) и TM288_E5GTT_RV (TM288_E517A_RV). GCT GGT GGC TGC GTC CAG TAT CAG G). Мутация D41A EfrE была введена с использованием праймеров EfrE_D41A_FW (CAA GTT GAT TGC TGT GGG CAT CG) и EfrE_D41A_RV (CGA TGC CCA CAG CAA TCA ACT TG). D50A EfrF был получен с использованием праймеров EfrF_D50A_FW (CAA TCG GGA TTG CTA ACC TCT TAG AAG C) и EfrF_D50A_RV (GCT TCT AAG AGG TTA GCA ATC CCG ATT G).Для сшивания транспортера в пучке тетраспирали в состоянии OF L200C TM287 вводили в cys-less TM287/288 (описано в ссылке 7 ) с использованием праймеров TM287_L200C_FW (GAG AAA ATC TCT GCG GTG TCA GGG TAG TGA G) и TM287_L200C_RV (CTC ACT ACC CTG ACA CCG CAG AGA TTT TCT C) и в сочетании с мутацией S224C TM288 с использованием праймеров TM288_S224C_FW (CAT AGA AGA AGA CAT CTG CGG CCT CAC TGT G) и TM288_S224C_RV (CAC AGT GAG GCC GCA GAT GTC TTC TTC TAT G).

Для спинового мечения sybody S71C вводили в Sb_TM#35 с использованием праймеров Sb_TM#35_S71C_FW (CAC GGT GTG CCT GGA CAA CG) и Sb_TM#35_S71C_RV (CGT TGT CCA GGC ACA CCG TG).

Для спин-мечения TM287/288 три новых цистеина были введены в TM287/288 без cys (для простоты называемые TM287/288 дикого типа). S271C TM287 был получен с использованием праймеров TM287_S271C_FW (CAG ATG GAG ATA GGA TGC ATC ATG GCA TAC) и TM287_S271C_RV (GTA TGC CAT GAT GCA TCC TAT CTC CAT CTG) в виде отдельного мутанта или в комбинации с K54C TM175 TM287 , который был создан с использованием праймеров TM287_K54C_FW (CTT TTC TCT GGT TTT GTG TAC AGG GAT CCT CAT G) и TM287_K54C_RV (CAT GAG GAT CCC TGT ACA CAA AAC CAG AGA AAA G).K54C TM287 также был получен в виде одиночного мутанта или в комбинации с I290C TM288 , введенным с праймерами TM288_I290C_FW (CGC CTT GAA AGA CTG TAT CAC GGT GGG) и TM288_I290C_RV (CCC ACC GTG ATA CAG TCT TTC TTC).

Все очищенные мутантные белки были проанализированы с помощью SEC и не отличались по профилю элюирования и выходу от транспортера дикого типа.

Кристаллизация

Для кристаллизации TM287/288(EtoA) или TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Sb_TM#35, свежеочищенный переносчик в 0. 3% (мас./об.) β-DM концентрировали примерно до 12 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и добавляли очищенный Sb_TM#35 (хранящийся при –80 °C) в кратный молярный избыток (конечная концентрация комплекса 10 мг/мл). Комплексы предварительно инкубировали с 2,5 мМ аденозин 5′-(3-тиотрифосфат) (ATPγS, Sigma, A1388) или 5 мМ АТФ, 3 мМ MgCl 2 в течение 5–6 дней при 20 °C (без этой стадии инкубации, кристаллы не дифрагировали с высоким разрешением), до этого кристаллы выращивали методом паровой диффузии в сидячих каплях (соотношение белок/резервуар 1:1) при 20 °C.Кристаллы собирали из лунок, содержащих либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,035 М NaCl и 11,5% (вес/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФγS), либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,025 М NaCl и 12% масса/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФ). Кристаллы появлялись в течение 1–3 дней и сразу же вылавливались. Кристаллы подвергали криозащите в 0,1 М растворе ацетата натрия, рН 4,6, 0,04 М растворе NaCl и 15 % (масса/объем) ПЭГ6000, дополнительно содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,3 % (масса/объем) β-ДМ. , 3 мМ MgCl 2 , 1,25 мМ АТФγS или 5 мМ АТФ и 25% (об./об.) этиленгликоля и мгновенно заморожены в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#1 к транспортеру, очищенному в 0,3% (масс./об.) β-ДМ в 1,2-кратный молярный избыток перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl и 0,3% ж/об) β-ДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl 2 в течение 15 мин на льду.Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка и резервуара 1:1) при 20 °С в 0,05 М глицина, рН 9,5, 0,225 М NaCl и 21% (об./об.) ПЭГ550ММЭ. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 3 недели. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе, содержащем 10% (об./об.) ПЭГ400, и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#2 к транспортеру, очищенному в 0, добавляли очищенный Nb_TM#2 (хранился при -80 °C).03% (мас./об.) β-DDM в 1,2-кратном молярном избытке перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% масса/объем) β-ДДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мкг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 2,5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl 2 в течение 15 мин на льду.Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка к резервуару 1:1) при 20 °С в 0,1 М трис-HCl, рН 8,5, 0,1 М NaCl и 30% (об./об.) ПЭГ400. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 2–3 недели. Кристаллы подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте без дополнительной криозащиты.

Сбор данных и определение структуры

Данные дифракции были собраны с длиной волны 1,0 Å при 100 K на линиях пучка X06DA и X06SA в Swiss Light Source (SLS, Villigen, Швейцария).Данные дифракции были обработаны с помощью программы XDS 39 и усечены с использованием сервера анизотропии дифракции с настройками по умолчанию 40 из-за сильной или серьезной анизотропии, что привело к улучшению карт электронной плотности (дополнительная таблица 1 ). Рис. 13 ).

Структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была решена путем молекулярной замены в Phaser 41 с использованием модифицированной модели гомологии на основе Sav1866 (PDB: 2HYD).Кристаллы относятся к пространственной группе P2 1 , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два синтела на асимметричное звено. После нескольких циклов построения модели в Coot 42 и уточнения в Buster (www.globalalphasing.com) полиаланиновая модель нанотела (PDB: 1ZVH) была вручную помещена в дополнительную электронную плотность. Многочисленные итерации построения модели в Coot и уточнения TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Рамачандран/отклонения: 96.54%/0,08%) (дополнительная таблица 1 ). Цепи A (TM287), B (TM288) и E (Sb_TM#35) использовали для структурного анализа и фигур.

Для определения структуры комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – ATP-Mg окончательная структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была использована для уточнения по сравнению с TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – данные АТФ-Mg. Были введены мутации 2xDtoA, и ATPγS был заменен на ATP в Coot. Уточнение TLS в Buster привело к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Рамачандран/отклонения: 96.58%/0,24%) (дополнительная таблица 1 ). Цепи A (TM287) и B (TM288) использовали для структурного сравнения со структурой комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg.

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#1 – ATPγS-Mg была решена путем молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody. Кристаллы принадлежат к пространственной группе P2 1 , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу.После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии, основанной на записи PDB 5OCL. Несколько итераций построения модели в Coot и уточнение TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (предпочтение/выбросы Рамачандрана: 94,68%/0,24%) (дополнительная таблица 1 ). Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#1).

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#2 – ATPγS-Mg была решена методом молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody. Кристаллы относятся к пространственной группе P1, содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу. После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии полиаланина, основанной на записи PDB 4LAJ. Несколько итераций построения модели в Coot и уточнение TLS в Buster привели к получению окончательной модели с разрешением 4,2 Å (предпочтение/выбросы Рамачандрана: 93,34%/0,83%) (дополнительная таблица 1 ).Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#2). Молекулярную графику и анализы выполняли в Pymol или с помощью UCSF Chimera 43 .

Анализы АТФазы

Активность АТФазы измеряли путем обнаружения высвобожденного фосфата с использованием метода молибдат/малахитовая зеленая. Для обнаружения фосфата реакционный раствор (90 мкл) смешивали с фильтрованным раствором для обнаружения малахитовой зелени (160 мкл), состоящим из 10,5 мг/мл молибдата аммония, 0,5 М H 2 SO 4 , 0. 34 мг/мл малахитового зеленого и 0,1% Triton X-100, поглощение измеряли при 650 нм 8 . Измерения активности АТФазы с белком, очищенным детергентом, проводили в АТФазном буфере, состоящем из 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ MgSO 4 , содержащего 0,03% (масса/объем) β-DDM. Измерения активности ТМ287/288, восстановленных в нанодисках, проводили в том же буфере без детергента. Измерения EfrEF, восстановленного в протеолипосомах, проводили в 50 мМ HEPES, pH 7.0 и 10  мМ MgSO 4 .

Относительная АТФазная активность TM287/288(D41A TM287 ), TM287/288(D65A TM288 ) и TM287/288(2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа измерялась при 25 5°C в течение 25 5 мин. в присутствии 500 мкМ АТФ. Использовали 32 нМ TM287/288 дикого типа, 64 нМ одиночных вариантов DtoA TM287/288 и 128 нМ TM287/288 (2xDtoA) и соответствующую концентрацию TM287/288 (EtoQ) для вычитания фона.

Относительную АТФазную стимуляцию вариантов EfrEF в протеолипосомах этидием определяли при 30 °C в течение 15 мин в присутствии 1 мМ АТФ. Количество восстановленных вариантов EfrEF определяли с помощью количественного SDS-PAGE. Использовали 4 нМ EfrEF дикого типа, 23 нМ одиночных вариантов DtoA EfrEF и 15 нМ EfrEF (2xDtoA), а для вычитания фона брали контрольные буферы.

Ингибирование АТФазной активности TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в детергенте связующими определяли в присутствии 500 мкМ АТФ при 25 °C в течение 30 минут или 60 минут соответственно. Использовали 8 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288(2xDtoA), что более чем в 2 раза меньше самой низкой концентрации связующего (20 нМ).Для вычитания фона использовали равные количества TM287/288(EtoQ). Для получения значений IC 50 данные по ингибированию аппроксимировали гиперболической кривой затухания со следующей функцией (SigmaPlot): соответствует АТФазной активности при соответствующей концентрации связующего, деленной на АТФазную активность в отсутствие ингибитора, нормализованную к 100%, y 0 соответствует остаточной активности при бесконечной концентрации связующего, а соответствует максимальной степени ингибирования ( a  +  y 0  = 100%), а x соответствует концентрации связующего.

Стимулированную АТФазную активность TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в нанодисках определяли при 37 °C в течение 30 минут в присутствии 500 мкМ АТФ и различных концентрациях Hoechst 33342. 40 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288 (2xDtoA) использовали для определения относительной стимуляции по сравнению с базовой активностью АТФазы с использованием буфера для вычитания фона.

Ингибирование активности АТФазы, стимулированное Hoechst 33342, в нанодисках определяли при 37°C в течение 30 мин в присутствии 500 мкМ АТФ и 50 мкМ Hoechst 33342.8 нМ TM287/288 дикого типа и 40 нМ TM287/288 (2xDtoA) в нанодисках использовали для определения активности АТФазы в присутствии или отсутствии 10 мкМ связующих с использованием пустых нанодисков для вычитания фона.

Сшивание BMOE

Чтобы вырастить нанотела альпака, специфически распознающие OF-состояние TM287/288, транспортер был сшит в тетраспиральном пучке, который формируется, когда транспортер принимает OF-состояние 13 . Два цистеина вводили в вариант TM287/288 без cys в положениях L200C , TM287 и S224C , TM288 посредством сайт-направленного мутагенеза.Кроме того, мутации 2xDtoA были введены в TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 . Поскольку два цистеина находятся слишком далеко друг от друга, чтобы образовать дисульфидную связь, был использован малеимидный сшивающий агент BMOE (бисмалеимидоэтан, Thermo Scientific™, #22323) с длиной 8 Å. TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 с мутациями 2xDtoA или без них экспрессировали, как описано выше. Мембраны солюбилизировали и очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA в присутствии 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) в 0.03% (мас./об.) β-ДДМ. Заменили буфер и удалили ДТТ с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в PBS, pH 7,4, и 0,03% (масса/объем) β-DDM при 4 °C и концентрировании до 50 мкМ. с концентратором Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа. Добавляли 10 мМ АТФ, 3 мМ MgCl 2 и 5-кратный молярный избыток BMOE по отношению к переносчику, и сшивающую смесь инкубировали в течение 3 ч при 30°С. Смесь разводили в 5 раз и инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) в течение ночи при 4 °C.Перекрестно-сшитый транспортер без меток был повторно загружен в колонку Ni-NTA с гравитационным потоком, уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 40 мМ имидазолом и 0,03% (вес / объем) β-DDM. Образец концентрировали с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, добавляли 10% (об./об.) глицерина, аликвоты подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте и хранили при –80 °C для подготовки к эксклюзионной хроматографии. . Сшитый TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 с мутациями 2xDtoA или без них очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl pH 7 .5, 150 мМ NaCl и 0,03% (мас./об.) β-DDM при 4°C и концентрировали до 1 мг/мл с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа и немедленно использовали для иммунизации альпаки.

Отбор нанотел и тел

Для отбора нанотел, специфичных для состояния OF, альпаку иммунизировали подкожными инъекциями четыре раза с двухнедельными интервалами, каждый раз 200 мкг очищенного сшитого TM287/288(2xDtoA)_cl_L200C TM287 /S224C TM288 в 20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. Иммунизация альпак была одобрена Кантональным ветеринарным управлением в Цюрихе, Швейцария (лицензия на эксперименты на животных № 188/2011). Кровь собирали через две недели после последней инъекции для получения РНК лимфоцитов, которую затем использовали для создания кДНК с помощью ОТ-ПЦР для амплификации репертуара VHH/нанотел. Были созданы библиотеки фагов и проведены два раунда фагового дисплея против TM287/288 (2xDtoA/EtoA), растворенных в β-DDM в присутствии 2  мМ ATP-Mg.После последнего раунда отбора фагового дисплея 91,9-кратное обогащение было определено с помощью количественной ПЦР с использованием AcrB в качестве фона. Обогащенную библиотеку нанотел субклонировали в pSb_init путем клонирования FX, и 94 отдельных клона анализировали с помощью ELISA в присутствии 1 мМ АТФ-Mg. 27 положительных результатов ELISA были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в три семейства в соответствии с длиной и последовательностью их CDR3 (среди них был Nb_TM#1). В другом отборе сшитые TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 использовали для иммунизации альпаки, что привело к 51 положительному результату ELISA, из которых 24 были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в четыре семейства связующих (среди них был Nb_TM#2).

Сителла были отобраны против TM287/288 (E517A) в β-DDM в присутствии 1 мМ АТФ-Mg с помощью нашей платформы для селекции in vitro 14 . После второго раунда фагового дисплея отдельные клоны анализировали на связывание с TM287/288 (E517A) в присутствии ATP-Mg с помощью ELISA. Секвенирование 48 положительных результатов ELISA привело к получению 40 уникальных последовательностей sybody 14 .

Спиновое мечение для DEER

Варианты TM287/288 цистеина экспрессировали, как описано выше, и очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA в присутствии 2  мМ DTT. Для спинового мечения DTT удаляли на колонке PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% β-DDM и MTSL [(1-оксил -2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил)метантиосульфонат, Toronto Research] добавляли в 10-кратном молярном избытке и инкубировали при 4 °C в течение ночи. Свободную спиновую метку удаляли эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. при 4 °С.Образцы концентрировали до концентрации 30–50 мкМ с помощью концентраторов Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C, готовых к экспериментам DEER. Пары 131 TM288 /248 TM288 и 460 TM287 /363 TM288 были уже использованы в предыдущих исследованиях 8 , 9 , в то время как внеклеточные пары спин-метки 54 TM287 /271 TM287 и 54 TM287 /290 TM288 были созданы в рамках этого исследования, и была определена их АТФазная активность (дополнительная таблица 3 ).

Для сайт-специфического спинового мечения Sb_TM#35 один цистеин был введен в каркас sybody в положении 71 посредством сайт-направленного мутагенеза. Sb_TM#35_S71C экспрессировали из pBXNPHM3, как описано выше. Клетки собирали и ресуспендировали в PBS с pH 7,4 и 2 мМ DTT с добавлением ДНКазы (Sigma) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™). Супернатант, дополненный 20 мМ имидазолом, наносили на колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, промывали 20 объемами колонки с PBS, pH 7.4, 50 мМ имидазола и 2 мМ DTT и элюировали 4 объемами колонки с PBS, pH 7,4, 300 мМ имидазолом и 2 мМ DTT.

На следующем этапе Sb_TM#35_S71C, слитый с His-меченым MBP, инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) при диализе против PBS pH 7,4 и 2 мМ DTT в течение ночи при комнатной температуре. Расщепленное sybody повторно загружали в колонку с гравитационным потоком Ni-NTA и элюировали тремя объемами колонки PBS pH 7,4, 40 мМ имидазолом и 2 мМ DTT с последующей эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Sepax-SRT10C SEC-300 (Sepax Technologies), уравновешенной с PBS pH 7. 4 и 2 мМ ДТТ. Собирали пиковые фракции и удаляли DTT с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной дегазированным PBS с pH 7,0, при 4°C. Чтобы избежать захвата DTT, сителла элюировали 3,2 мл дегазированного PBS с pH 7,0 вместо 3,5 мл, предложенных производителем. Элюат концентрировали до 2,5 мл с использованием концентратора Amicon с MWCO 3 кДа. К образцу добавляли 5-кратный молярный избыток MTSL и инкубировали в течение 1 часа на льду, что, как сообщалось ранее, предотвращает мечение скрытых цистеинов, образующих универсально консервативную дисульфидную связь нанотел 44 .Свободную метку удаляли и заменяли буфер с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl. Чтобы избежать захвата MTSL, сителла элюировали 3,2 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl. Спин-меченые sybody концентрировали до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 3  кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C. Специфическое для сайта мечение было подтверждено и количественно определено с помощью масс-спектрометрии.

Измерения DEER

Эффективность мечения двойных цистеиновых мутантов транспортеров, солюбилизированных в детергенте, измеряли путем сравнения второго интеграла спектров, зарегистрированных при 25 °C с использованием ЭПР-спектрометра X-диапазона Miniscope 400 (Magnettech by Freiberg Instruments) со стандартным водным раствором TEMPOL. Расчетная эффективность спинового мечения двенадцати мутантов колебалась от 80% до 90%. Для измерения DEER в качестве криопротектора добавляли 10% (об./об.) D 8 -глицерина.Диапазон конечных концентраций транспортера составлял от 15 до 25 мкМ. Образец (40 мкл) помещали в кварцевые пробирки с внешним диаметром 3 мм. Образец АТФ-ЭДТА содержал 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) для полного ингибирования гидролиза АТФ; образцы инкубировали при 25 °C в течение 10 мин и быстро замораживали в жидком азоте. Для улавливания ванадата образцы инкубировали с 5 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ MgCl 2 в течение 3 мин при 50   °C и мгновенно замораживали в жидком азоте. Немеченый Sb_TM#35 добавляли к TM287/288 в стехиометрическом соотношении ~1,3:1. Для измерения расстояний sybody-транспортер Sb_TM#35, меченный спином в положении 71, добавляли в стехиометрическом соотношении 0,5:1 к однократно меченым мутантам TM287/288 (54 TM287 и 271 TM287 ) в присутствии АТФ. — ЭДТА.

Измерения двойного электрон-электронного резонанса (DEER) проводились при 50 K на импульсном спектрометре Q-диапазона Bruker ELEXSYS E580Q-AWG (генератор сигналов произвольной формы), оснащенном усилителем TWT мощностью 150 Вт.Использовалась 4-импульсная последовательность DEER с гауссовским, неселективным наблюдателем и импульсами накачки длительностью 32 или 34 нс (соответствует 14 или 16 нс на полувысоте) с частотным разделением 100 МГц. Из-за когерентного характера импульсов, генерируемых генератором сигналов произвольной формы, для удаления эффекты бегущих эхо-сигналов от трассы DEER. Оценка данных DEER проводилась с помощью DeerAnalysis2015 45 . Фон первичных следов DEER корректировали с помощью растянутых экспоненциальных функций с однородными размерностями от 1,8 до 3 для разных выборок. Безмодельная регуляризация Тихонова использовалась для извлечения распределений расстояний из скорректированных по фону форм-факторов. Данные состояний апо и АТФ-ЭДТА, показанные для пар 131 TM288 /248 TM288 и 460 TM287 /363 TM288 в отсутствие sybody, воспроизводимы относительно ранее опубликованных 51903 .Моделирование межспинового расстояния было выполнено с помощью программного обеспечения MMM2015 с использованием библиотеки температуры окружающей среды MTSL 46 , 47 .

Транспортный анализ

L. lactis NZ9000 ΔLMRAδLMRCD Клетки, укрывающие плазмиды дикого типа или мутантного Efref, были выращены в среде M17, дополненные 0,5% глюкозой и 5 мкг / мл хлорамфеникола до 600 0,4 –0,6 при 30 °C, а экспрессию индуцировали добавлением низинсодержащего культурального супернатанта объемом 90×115 л. lactis NZ9700 в течение 2 ч (1:1000 [об./об.]). Клетки промывали и ресуспендировали с использованием флуоресцентного буфера (50 мМ KP i , pH 7,0 и 5 мМ MgSO 4 ). Клетки разбавляли до ОП 600 0,5 и активировали путем добавления 0,5% глюкозы. Накопление 5 мкМ этидия контролировали при 30 °C с помощью флуоресцентного спектрометра LS-55 (Perkin Elmer, Шверценбах, Швейцария). Длины волн возбуждения и излучения (и ширина щели) были установлены на 520 нм (10 нм) и 595 нм (15 нм) 16 , 17 .

Восстановление в протеолипосомы

E. coli полярные липиды, экстрагированные из E. coli общие липиды (Avanti lipids 100500 P) и L-α-фосфатидилхолин (из яичного желтка, тип ≥CTL9-E, ≉9 ) P3556 Sigma) растворяли в хлороформе. Липиды смешивали в соотношении 3:1 (вес/вес), хлороформ выпаривали и высушенные липиды растворяли в буфере для восстановления (50 мМ K-HEPES, pH 7,0). Липиды обрабатывали ультразвуком для получения небольших однослойных везикул (SUV). Внедорожники были мгновенно заморожены в жидком азоте и оттаивались четыре раза, чтобы сплавить их в большие мультиламеллярные везикулы (LMV).Наконец, большие однослойные везикулы (LUV) были сформированы путем экструзии LMV через поликарбонатный фильтр 400 нм. LUV разбавляли до рабочей концентрации 4 мг/мл и дестабилизировали с использованием 5,25 мМ Triton X-100. Очищенные детергентом варианты EfrEF добавляли к дестабилизированным липосомам в соотношении белок:липид 1:100. Молекулы детергента удаляли четырьмя циклами добавления и удаления 200 мг биогранул (полистироловые гранулы SM-2, Bio-Rad). Протеолипосомы собирали центрифугированием (40 000 об/мин, ротор 70 Ti, Beckman) и ресуспендировали в 50 мМ K-HEPES pH 7.0 16 .

Поверхностный плазмонный резонанс

Сродство связывания определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 °C с использованием системы ProteOn™ XPR36 Protein Interaction Array System (Biorad). Биотинилированные варианты TM287/288 были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 2000 RU. Нанотела и синтела, экспрессированные в pSb_init, подвергали гель-фильтрации в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl, а измерения SPR проводили в том же буфере, содержащем 0.015% (w/v) β-DDM и либо 1 мМ MgCl 2 , либо 1 мМ MgCl 2 и 0,5 мМ АТФ для измерения аффинности связывания в отсутствие или в присутствии АТФ, соответственно. Каждое измерение проводилось один раз, и данные соответствовали модели взаимодействия 1:1 с использованием программного обеспечения BioRad Proteon Analysis. Чтобы определить периоды полураспада различных вариантов TM287/288, связанных с АТФ, все пять биотинилированных вариантов были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 3000 RU.Эксперимент проводился в 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,015% (масса/объем) β-DDM и 1 мМ MgCl 2 или 2,5 мМ ЭДТА при 25  °C при скорости потока 30 мкл/мин. Чтобы зарядить варианты переносчика АТФ-Mg или АТФ-ЭДТА, в начале эксперимента вводили буфер, содержащий 1 мМ АТФ вместе с 1 мМ MgCl 2 или 2,5 мМ ЭДТА.

Подготовка нанодисков

Мембранный каркасный белок MSP1E3D1 был субклонирован из pINITIAL (предоставлен Prof.Raimund Dutzler) в pBXNh4 (адген: плазмида № 47067) путем клонирования FX 36 . Свежетрансформированные клетки E. coli MC1061 выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина до OD 600 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017% /v) L-арабиноза в течение ночи при 22 °C. Клетки собирали, ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Na-фосфата, pH 7,4, 1% (об./об.) Triton X-100 и 1 мМ PMSF) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™).Клеточный дебрис осаждали при 8000 г в течение 30 мин при 4°С, а супернатант загружали в гравитационную колонку Ni-NTA, уравновешенную буфером для лизиса, промывали 10 объемами колонки с буфером 1 (40 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М). NaCl и 1% (об./об.) Triton X-100), 10 объемов колонки, буфер 2 (буфер 1 + 50 мМ холата натрия), 10 объемов колонки, буфер A (40 мМ трис-HCl, pH 8,0 и 0,3 M NaCl), 10 колоночные объемы буфера А, содержащие 20 мМ имидазола, и, наконец, элюировали 4 колоночными объемами буфера А, содержащего 300 мМ имидазола. Добавляли протеазу 3 C (1:10 масс./масс.) и образец подвергали диализу в течение ночи при 4 °C против 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,5 мМ K-ЭДТА. На следующий день к образцу добавляли 2 мМ MgCl 2 , который затем повторно загружали в гравитационную колонку Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 20 мМ имидазолом, и элюировали двумя тома столбцов с использованием одного и того же буфера. Буфер заменяли путем трехкратного диализа против Tris-HCl pH 7,5 и 0,5 мМ K-EDTA в течение 1,5 часов при комнатной температуре.Очищенный мембранный каркасный белок концентрировали до 60 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 10 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

Полярные липиды E. coli (экстракт полярных липидов E. coli , Avanti, 100600C) смешивали 3:1 (мас./мас.) с L-α-фосфатидилхолином из яичного желтка (Sigma, P3556) и хлороформом. испарился. Высушенные липиды растворяли в 20 мМ HEPES pH 8,0, 0,5 мМ K-ЭДТА, 100 мМ NaCl и 100 мМ холата до конечной концентрации 38 мг/мл (50 мМ) и фильтровали с использованием 0. Фильтр 22 мкМ. Липиды, готовые для воссоздания нанодисков, хранили при температуре -80 °C.

Очищенные, биотинилированные варианты TM287/288, солюбилизированные в β-DDM, были преобразованы в нанодиски с использованием молярного соотношения липидов 240:8:1:MSP1E3D1:TM287/288. Чтобы сэкономить мембранный белок, идеальное соотношение липидов: MSP1E3D1 было определено заранее путем восстановления пустых нанодисков. Были протестированы различные соотношения в диапазоне от 25:1 до 40:1 (липид:MSP1E3D1). Пустые нанодиски загружали в колонку Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare) для отделения пустых нанодисков от мономерного MSP1E3D1 и агрегатов.Из профиля элюции было определено оптимальное соотношение липид:MSP1E3D1 30:1. Конечная концентрация холата в смеси для восстановления была доведена до 30 мМ. Смесь инкубировали при 25°С в течение 20 мин при покачивании со скоростью 650 об/мин. Затем к 200 мкл восстанавливающей смеси добавляли 200 мг биогранул, которые инкубировали в течение ночи при 4 °C при покачивании со скоростью 1000 об/мин. Биошарики удаляли с помощью центробежных фильтров 0,1 мкм из ПВДФ. Полные нанодиски отделяли от пустых нанодисков с помощью гель-фильтрации с использованием Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенного 20 мМ Tris-HCl pH 7.5 и 150 мМ NaCl. Профиль SEC, а также анализ SDS-PAGE восстановленного нанодиска TM287/288 показан на дополнительном рисунке 2c . Варианты TM287/288, восстановленные в нанодисках, либо сразу использовали, либо мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C.

Моделирование МД

Настройка и параметры моделирования аналогичны нашей предыдущей работе 11 . Вкратце, с помощью GROMACS 48 было проведено МД-моделирование всех атомов TM287/288, встроенных в явно сольватированный бислой POPC.Следует отметить, что исходный организм TM287/288, гипертермофильная бактерия Thermotoga maritima , имеет уникальный липидный состав 49 , который трудно реализовать для моделирования МД. Для моделирования, инициированного со структурой IF (PDB: 4Q4A), ATP-Mg был присоединен к консенсусному сайту, а D41 TM287 и D65 TM288 были заменены аланинами. Мы провели 20 отдельных симуляций по 500 нс каждая (т.е. всего 10 мкс) при 375 К.Кроме того, было смоделировано состояние OF, начиная с кристаллической структуры (PDB: 6QUZ), показанной на рис., после удаления sybody и замены ATPγS на ATP. Кроме того, тот же набор симуляций был проведен для структуры OF, связанной с АТФ, в которой мутации 2xDtoA были введены in silico (всего еще 8 мкс). Кроме того, была смоделирована рентгеновская структура ОВ дикого типа в бислое POPE (вместо POPC) при 375 K (десять симуляций по 500 нс каждая, т.е. всего 5 мкс).

Ворота качества

Ворота качества — лучший способ обеспечить соблюдение политики качества в вашей организации.Он должен ответить на ОДИН вопрос: могу ли я сдать свой проект в производство сегодня или нет?

Чтобы ответить на этот вопрос, вы определяете набор логических условий на основе пороговых значений показателей, по которым оцениваются проекты. Например:

  • Нет проблем с новыми блокировщиками
  • Покрытие нового кода более 80 %
  • и т. д.

В идеале все проекты должны проверяться по одному и тому же порогу качества, но это не всегда практично. Например, вы можете обнаружить, что:

  • Технологическая реализация отличается от одного приложения к другому (вам может не потребоваться одинаковое покрытие кода для нового кода для веб-приложений или приложений Java).
  • Вы хотите обеспечить более строгие требования к некоторым из ваших приложений (например, к внутренним платформам).
  • и т. д.

Вот почему вы можете определить столько ворот качества, сколько пожелаете. Контрольные точки качества определяются и управляются на странице Контрольные точки качества в верхнем меню.

Ворота качества «Sonar way» предоставлены SonarSource, активированы по умолчанию и считаются встроенными и поэтому доступны только для чтения. Он представляет наш взгляд на наилучший способ реализации концепции «Устранение утечки воды». В каждом выпуске SonarQube мы автоматически корректируем этот порог качества по умолчанию в соответствии с возможностями SonarQube.

Три показателя позволяют применять заданный рейтинг надежности, безопасности и ремонтопригодности не только в целом, но и для нового кода. Эти метрики являются рекомендуемыми и входят в стандартные критерии качества. Мы настоятельно рекомендуем вам настроить свои собственные пороги качества, чтобы использовать их, чтобы сделать обратную связь более понятной для ваших разработчиков, просматривающих свои пороги качества на странице своего проекта.

Не забывайте также, что условия ворот качества должны использовать дифференциальные значения. Например, нет смысла проверять абсолютное значение, такое как: Количество строк кода больше 1000.

Рекомендуемый контроль качества

Сонарный путь Встроенные ворота качества рекомендуются для большинства проектов. Если фокусируется на поддержании чистоты нового кода, а не на исправлении старого кода. По умолчанию он уже установлен в качестве профиля по умолчанию.

Текущее состояние отображается на видном месте в верхней части страницы проекта:

Благодаря механизму уведомления пользователи могут быть уведомлены о сбое шлюза качества.Для этого подпишитесь на уведомление о новом статусе ворот качества либо для всех проектов, либо для набора проектов, которые вас интересуют.

Ворота качества доступны любому пользователю (даже анонимному). Все пользователи могут просматривать каждый аспект ворот качества.

Для внесения изменений (создания, редактирования или удаления) пользователям должно быть предоставлено разрешение «Администрирование профилей качества и шлюзов ».

Администратор проекта может выбрать, с какими воротами качества связан его/ее проект.Дополнительные сведения см. в разделе Настройки проекта.

Для управления контрольными точками качества перейдите к контрольным точкам качества (верхняя строка меню).

Каждое условие Quality Gate представляет собой комбинацию:

  • мера
  • период: Значение (на сегодняшний день) или Новый код (дифференциальное значение за период действия Нового кода)
  • оператор сравнения
  • значение предупреждения (необязательно)
  • значение ошибки (необязательно)

Например, условие может быть:

  • Мера: выпуск блокировщика
  • период: Значение
  • оператор сравнения: >
  • значение ошибки: 0

Что можно сказать так: Нет проблем с блокировщиком.

Конструкция ворот | АМИЛАН™ | ТОРАЙ ПЛАСТИКС

Техническая информация|Литье под давлением|Конструкция ворот

Конструкцию литника следует учитывать на этапе проектирования изделия и до этапа проектирования пресс-формы.

Отношения местоположения между воротами и другими компонентами

Рисунок 4.1: Отношения местоположения
ворота и другие компоненты

См. Рисунок 4.1 для иллюстрации взаимного расположения литника, литника, полости и колодца холодной пробки.

Бегун

Поперечное сечение бегунка может иметь форму круга, полукруга или трапеции; однако наиболее распространена круглая форма, так как она имеет наименьшее сопротивление потоку. В таблице 4.1 показано соотношение между толщиной изделия и диаметром и длиной круглого желоба.

Таблица 4.1: Размеры и длина направляющей
Бегун
диаметр

(ммφ)
Максимальная длина рабочего колеса (мм) от литниковой втулки, ближайшей к полости Товар
толщина
(мм)
3-4.5 150 4,5
6-7,5 300 6
9 370 6

Рисунок 4.2: Полукруглая и трапециевидная форма
беговые формы

На рис. 4.2 показано соотношение между глубиной h, ширинами W и B и радиусом r в полукруглом и трапециевидном желобе.

Типы ворот

Таблица 4.2 представлены 10 часто используемых типов ворот. Красным шрифтом обозначены ворота, подходящие для применения с нейлоном.
На рис. 4.3 показаны различные типы поперечных сечений ворот.

Рисунок 4.3: Различные типы поперечного сечения ворот

Выбор местоположения ворот

Ⅰ. На основе производительности продукта

  • Дизайн: С точки зрения внешнего вида, где допустимы метки ворот и отделочные метки?
  • Точность размеров: впрыск от центра при формовании деталей, требующих круглой формы, таких как шестерни и валы.Не размещайте ворота в местах со строгими требованиями к размерам.
  • Прочность: Предскажите, где могут возникнуть линии сварки, и примите во внимание прочность таких мест. Если в таких местах нельзя снизить прочность, измените расположение ворот.

Ⅱ. Исходя из количества продуктов на выстрел

Учитывайте, получается ли при каждом выстреле одна или несколько деталей.
Хорошо ли сбалансировано давление открытия формы с учетом литника, размещения полости и давления впрыска полимера? Если давление открывания формы распределяется неправильно, могут возникнуть заусенцы и деформация формы.

Ⅲ. По экономике отделочных работ

Решите, использовать ли точечные ворота (для которых требуется форма, состоящая из трех компонентов), подводные ворота (что устраняет необходимость в отделке) или обычные ворота.

Ⅳ. На основе формуемости материала

Выберите тип литника и определите его расположение с учетом текучести материала, обесцвечивания при воздействии тепла и деформации при формовании.

Баланс ворот

В конструкции литника расплавленный полимер должен одновременно подаваться ко всем литникам и одновременно заполнять полость.Плохая балансировка литников может привести к появлению следов текучести, прижогов и другим проблемам внешнего вида, а также к несоответствию прочности формованных изделий.

Ⅰ. Сделать компоновку полости сбалансированной

На рисунках 4.4 и 4.5 показана конструкция, в которой материал равномерно течет по направляющим и одновременно достигает всех ворот. Недостатком здесь является то, что бегуны относительно длинные.

Рисунок 4.4: Баланс ворот

Рисунок 4.5: Баланс ворот

Ⅱ.Отрегулировать площадь поперечного сечения ворот

Предполагая, что используются часто используемые направляющие, попытайтесь добиться баланса литников, регулируя площадь поперечного сечения каждой литниковой поверхности для достижения равномерного заполнения.
Формула 6:

Тогда как:
W: Вес полимера, проходящего через (г)
SG: Площадь поперечного сечения ворот (мм 2 )
: Длина направляющей до ворот (мм)
: Длина площадки ворот (мм)
K: константа, определяемая свойствами полимера и формой
Проблема
Предполагая, что вы используете направляющую, показанную ниже, рассчитайте площадь поперечного сечения для каждой заслонки — S G1 , S G2 , S G3 , S G4 и S G5
.

Ответить
Предположим, что площадь поперечного сечения литника S G3 , находящегося в непосредственном контакте с литником, составляет 1% от площади рабочего колеса.В этом случае S G3 = 0,01×π×4,5 2 /4=0,159 мм 2 . Предположим, что площадь поверхности поперечного сечения ворот имеет прямоугольную форму и что отношение между шириной ворот W и глубиной ворот h может быть выражено как W = 3h. В этом случае S G3 =Ш×В=3h3=0,159. Следовательно, h3 = 0,053, h = 0,23 мм и W = 0,69 мм. Таким образом, площадь затвора L G3 будет равна 0,23 мм, что соответствует глубине затвора.
Предположим:
1 = 5 = 60, 2 = 4 = 30, 3 = 4.5/2, S G =3h 2 , =h
По формуле 2.3:

Вставьте 1 = 5 = 60 и привет, 5 = 1,25.
Вставка 2 = 4 = 30 и h 2 h 4 = 0,887
В заключение
S G1 и S G5 имеют размер 4,68 мм 2 . S G2 — S G4 — 2,42 мм 2 . S G3 — 0,159 мм 2 , а W 1 и W 5 — 3.75 мм. W 2 и W 4 — 2,7 мм, а W 3 — 0,69 мм.
h 1 и h 5 составляют 1,25 мм. h 2 и h 4  равны 0,887 мм, а h 3 равны 0,23 мм.

Размеры ворот

Используйте Таблицу 4.3 в качестве руководства.
Безопасный и надежный подход заключается в постепенном расширении ворот после формования и подтверждения результата формованного изделия.

Таблица 4.3: Размеры ворот
Толщина изделия Круглые ворота Прямоугольные ворота
Диаметр
(мм)
Длина суши

(мм)
Глубина
(мм)
Ширина
(мм)
Длина суши
(мм)
3 мм или менее нейлон 6 1. от 0 до 1/2 толщины продукта Не более 1,0 1/2 толщины изделия Равна толщине изделия (не менее 1,5) Не более 1,0
нейлон 66 от 0,75 до 1/2 толщины изделия от 0,75 до 1/2 толщины изделия
3-6 мм нейлон 6 1.0-3,0 Не более 1,5 1/2 толщины изделия от 1/2 до 3/4 толщины изделия Не более 1,5
нейлон 66 0,75-3,0 0,75-3,0
6 мм или больше нейлон 6 3,0-4,5 Не более 1/2 диаметра ворот 3.0-4,5 4,5 Не более 3,1
нейлон 66 3,0-4,5 3,0-4,5

Эти выдвижные детские ворота — лучшие детские ворота, которые я когда-либо использовал

Я люблю свой дом, но у него есть один большой недостаток: Везде лестницы. Вот почему мы приступили к поиску лучших выдвижных детских ворот, когда пришло время защитить наш дом от детей.

Как бы мы ни искали, сколько бы магазинов мы ни проверили, мы не могли найти ворота, которые работали должным образом. Таким образом, поскольку задача оказалась сложнее, чем ожидалось, мы перешли к остальной части контрольного списка защиты от детей. Конечно, именно тогда наш старший решил совершить ужасное падение с упомянутой лестницы. К счастью, он был в порядке, но мне пришлось искать немедленное решение.

Обратившись к Интернету, я прочитал множество отзывов о различных воротах и ​​остановился на одном, который, по крайней мере, согласно веб-сайту, подходил для нашей уникальной ситуации: Retract-A-Gate от Smart Retract.Retract-A-Gate сделан не из твердого дерева или пластика, а из пластиковой сетки, которая работает как рулонная оконная штора; вы просто вытягиваете его настолько далеко, насколько это необходимо, чтобы покрыть нижнюю или верхнюю часть лестницы.

Лучшие выдвижные детские ворота

Эта выдвижная детская калитка сворачивается, как оконная штора.

Он имеет размеры 34 дюйма в высоту и 52 или 72 дюйма в длину (если вам нужно заблокировать всю область), а с другой стороны он крепится с помощью замка для защиты от детей.Вы можете легко управлять воротами одной рукой, когда вы жонглируете малышом или некоторыми продуктами, и они прекрасно подходят для нетрадиционных пространств ⏤ Я могу это подтвердить. Еще лучше, если вы купите дополнительный монтажный комплект, его можно будет перемещать из одного места в доме в другое.

Честно говоря, одна из самых больших проблем, с которыми я столкнулся при работе с Retract-A-Gate, заключалась в том, чтобы заказать эту чертову штуку, потому что есть множество вариантов.

Выдвижные детские ворота Мейнкинда — еще один отличный вариант. Его высота составляет 34,6 дюйма, а ширина достигает 48 дюймов. Вы можете установить его в верхней и нижней части лестниц, дверных проемов и коридоров.

К счастью, заказанные нами ворота (в черном цвете, хотя они также продаются в белом цвете или цвете мокко) прибыли со всеми необходимыми деталями, и их было довольно легко установить. В нашем случае у нас был деревянный столб с одной стороны и неудобные перила, которые не подходили к большинству ворот, с другой. У нас не было никаких проблем с установкой, и ворота Smart Retract работали так хорошо, что мы купили еще один наверх после рождения нашего второго ребенка.Я рад сообщить, что с тех пор, как мы их установили, наш дом ⏤ простите, наши лестницы ⏤ остались без происшествий.

Эти сетчатые выдвижные детские ворота выдвигаются на 360 градусов. Сетчатая подкладка сворачивается, экономя место, и оснащена замком, открывающим ворота одной рукой. Его ширина 54 дюйма.

Тем не менее, Retract-A-Gate не лишен недостатков. Во-первых, это недешево — 120 долларов (150 долларов за 72-дюймовую модель), и это без каких-либо дополнительных ограждений, оборудования или анкерных комплектов.Во-вторых, даже в запертом положении в центре ворот немного больше прогиба, чем хотелось бы. И хотя не иметь открывающихся и закрывающихся металлических ворот каждый раз, когда я хочу прокрасться вниз во время сна, это облегчение, Retract-A-Gate не так надежен, как его металлические или твердые пластиковые аналоги. И в-третьих, чрезвычайно мотивированный (или находчивый) ребенок может проскользнуть, если он знает, как это сделать ⏤, хотя ворота все равно должны замедлить их достаточно, чтобы вы могли поймать их, прежде чем они убегут.

При всем при этом Retract-A-Gate хорошо работает для нас. Он прекрасно вписывается в нашу нетрадиционную ситуацию с лестницей и безопасен, но не является излишним или бельмом на глазу. Они легко вкатываются, оставляют низкий профиль на стене и их не сложнее установить, чем другие традиционные ворота. Более того, это успокаивает меня и почти избавляет от чувства вины, которое я все еще питаю из-за того, что мой ребенок упал с лестницы. Почти.

Каждый продукт на сайте Fatherly независимо отбирается нашими редакторами, писателями и экспертами.Если вы нажмете ссылку на нашем сайте и что-то купите, мы можем получить партнерскую комиссию.

Ой! Пожалуйста, попробуйте еще раз.

Спасибо за подписку!

.